Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
4. Экстракцию ДНК необходимо начинать как можно скорее после сбора свежей ткани или расконсервации биологических образцов.
5. Образцом для ДНК-анализа служат фрагменты любых доступных тканей и кровь.
Ткань может храниться в условиях низкой температуры в холодильнике в течение нескольких дней без риска сильной деградации ДНК, однако, если ДНК из биологических образцов не может быть экстрагирована в ближайшие 48 часов, биологический образец должен быть заморожен до температуры от — 20°С до — 80°С. Качество и количество экстрагируемой ДНК уменьшается со временем и зависит от условий хранения биологических образцов после забора материала, и, следовательно, для улучшения хранения образцов может потребоваться модификация общепринятых процедур.
При отсутствии сухого льда допускается закладка биологических образцов в растворы этанола, пропанола или эфира, однако при этом процесс экстракции ДНК осложняется химической денатурацией поверхностных слоев биологических образцов на фоне не прекращающихся процессов деградации ДНК глубинных слоев биологических образцов. При этом целесообразно использовать для хранения и перевозки образцов одноразовые пластиковые, плотно закрывающиеся емкости, помещаемые затем в полиэтиленовые пакеты.
Количества ДНК, выделенной из 1 мл крови, более чем достаточно для генотипирования методами ПЦР-анализа, и, как правило, можно ограничиться даже меньшим количеством биологического образца (табл. 1). ДНК, необходимая для проведения ПЦР-анализа, может быть выде-
лена из высушенных пятен крови более чем десятилетней давности, при условии, что материал хранился в надлежащих условиях (например, в сухом, прохладном месте). Эти биологические материалы могут понадобиться для повторного ДНК-типирования в тех случаях, когда результаты экспертизы все еще находятся под сомнением.
Таблица 1 Содержание ДНК в различных тканях
[по L.T. Kirby, 1992]
Источник Относительное содержание
ДНК
1. Амниотическая 65 нг/мл (1 х 104 клеток/мл на
жидкость 16 неделе беременности)
2. Кровь 40 мкг/мл (в 1 мкл от 4x103 до
(млекопитающие) 11 х 103 белых клеток крови)
3. Ворсинки эпите 8 мкг/мг
лия хориона
4. Культура 6,5 мкг/Т25 флакон (приблизи
фибробластов тельно 1х106 клеток)
5. Корни волос (све- 250 нг/волос
жевырванные)
6. Печень 15 мкг/ мг
7. Мышцы 3 мкг/ мг
8. Кожа 3 мкг/ мг
9. Сперматозоиды 3,3 пкг/клетку
Мышцы содержат значительное количество ДНК, поэтому 50 миллиграммов ткани более чем достаточно для проведения анализа. Желательно производить отбор из разных мест ткани, потому что качество ДНК может измениться в зависимости от действия ДНК-аз.
Как следует из таблицы 1, количество материала, требуемого для анализа, может варьировать в зависимости от типа анализа и вида ткани. При использовании метода ферментативной амплификации ДНК вполне достаточно миллиграмма образца. Действие ДНК-аз играет определяющую роль в деградации ДНК биологических образцов. Хранение биоматериала при низкой температуре значительно снижает ферментативную деградацию ДНК.
Vfe 2. Зак 577
ТРАНСПОРТИРОВКА БИОЛОГИЧЕСКОГО
МАТЕРИАЛА
Несоблюдение правил погрузочно-разгрузоч-ных операций и хранения может приводить к тому, что образцы становятся непригодными для анализа. Это особенно важно в экспертнокриминалистической работе, когда количество биологических образцов минимально.
Полностью экстрагированная ДНК может перевозиться при комнатной температуре, храниться при +4°С в течение месяцев, смешанная с хлороформом (5 мкл/мл раствора ДНК) и сохраняться неопределенно долго в замороженном состоянии. Повторение циклов замораживания-оттаивания не рекомендуется из-за возможности разрушения ДНК.
Транспортировка курьерской службой со сроком доставки один или два дня является обязательной процедурой, потому что такие грузы могут быть легко найдены в случае потери биологических образцов при транспортировке. Почтовая пересылка является менее надежной и допустима только в крайних случаях.
Биологические образцы для ДНК-типирования транспортируются доступными средствами в сопровождении обученного персонала с соблюдением норм температурного и временного режимов транспортировки биологических грузов и мер безопасности, принятых при работе с
потенциально патогенным материалом, и снабжаются соответствующей маркировкой.
Все первичные ёмкости должны быть помещены во вторичные ёмкости (например, полиэтиленовые пакеты) для лучшей изоляции друг от друга. Третий, большой полиэтиленовый мешок должен использоваться, для того чтобы сложить все образцы от одного потерпевшего вместе. Подробное описание образца и любые другие документы, имеющие к нему отношение, должны быть помещены в отдельный изолированный полиэтиленовый пакет. Ткани должны быть упакованы в изолированном контейнере с необходимым количеством твердой углекислоты (приблизительно три части веса углекислоты на одну часть веса образца в зависимости от температуры окружающей среды). Нельзя использовать для упаковки стеклянные или хрупкие ёмкости. При отсутствии твердой углекислоты, можно использовать для транспортировки обыкновенный лед. Цельная кровь должна быть охлаждена, но не должна быть заморожена. Крайне внимательно необходимо отнестись к упаковке образцов для ДНК-типирования в надежные специализированные емкости, помеченные должным образом, снабженные ярлыками и соответствующей документацией.
