Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
Должна быть обеспечена четкая организация и бесперебойное функционирование инфраструктуры, позволяющей сохранять биологические пробы неопределенно долгое (или необхо-
димое для заданного срока хранения) время без изменения их свойств. Наиболее широко используемым методом хранения биологических образцов является криоконсервация. К достоинствам этого метода следует отнести простоту предварительной подготовки проб для хранения и последующего их использования для экспертных процедур. Для выделения ДНК из крикон-сервированных образцов вполне пригодны общепринятые и описанные в литературе методические подходы, применяемые для экстракции ДНК из нативных тканей. К недостаткам метода криоконсервации следует отнести следующие: потенциальная возможность сохранения патогенных возбудителей вместе с образцом, необходимость постоянного поддержания бесперебойной работы холодильного оборудования и обязательной организации фиксации терморежимов хранения и бесперебойного энергоснабжения (если речь идет о холодильных установках). Для надежного хранения биологических образцов в холодильных установках необходимо иметь также резервные автономные генераторы электроэнергии и резервные мощности холодильных установок на случай выхода из строя части основного оборудования. В криодепозитарии необходимо организовать круглосуточное дежурство для оперативного решения возникающих проблем с замороженными пробами. При криоконсервации биологических проб самой важной является проблема выбора темпера-
турного режима криоконсервации. В идеальном случае, при хранении проб в жидком азоте, такая проблема вообще не возникает, так как температура жидкого азота постоянно поддерживается на уровне — 195,8°С (точка кипения жидкого азота). Этот режим позволяет осуществлять быстрое замораживание в максимально щадящем режиме и хранить ткани без ограничения срока хранения по времени и без каких-либо потерь биологических свойств материала. При замораживании в промышленных холодильных установках при относительно высоких температурах (до — 30°С) процесс замораживания намного более растянут во времени по сравнению с условиями в жидком азоте. Это приводит к тому, что в биологических пробах формируются относительно крупные кристаллы льда и лакуны, наполненные относительно большими концентрациями электролитов, вымороженных из тканей в процессе постепенного охлаждения. Сформированная таким образом структура ткани несет в себе относительно большое количество повреждений, количество которых впоследствии увеличивается при неправильно подобранном температурном режиме хранения. Поэтому для хранения в условиях промышленных холодильных установок необходимо выбрать оптимальную температуру хранения образцов: это нужно учитывать как при приобретении холодильных установок, так и при регулировке их рабочих параметров. Учитывая данные по реологическим
свойствам биологических тканей при замораживании, оптимальными условиями для хранения следует признать температурный режим не ниже — 40°С. Это объясняется тем, что биологические ткани, в отличие от воды, содержат в себе большую концентрацию электролитов, существенно понижающих температуру замерзания растворов. Это приводит к тому, что биологические ткани при температуре хранения — 20°С и выше претерпевают многократные циклы замораживания — оттаивания (специфика работы любой холодильной установки заключается в том, что для поддержания заданной температуры компрессор холодильника периодически включается и выключается, вызывая периодические колебания температуры относительно заданной точки). Периодическое замораживание-оттаивание приводит к разрушению внутриклеточных структур и больших молекул (а именно к ним относится ДНК) микрокристаллами льда, что приводит к падению титра нативных молекул и (не менее важно!) значительно ускоряет биодеградацию размороженных проб, если оперативно не приступить к экстракции ДНК с сопутствующей инактивацией внутритканевых ДНК-аз. Все процедуры по хранению, приемке, получению и выдаче образцов должны быть строго документированы с указанием лиц, ответственных за выдачу — получение материала, указанием оснований для экспертизы и количественной характеристики остатка материала в
депозитарии. Если для анализа требуется выдача всего образца без остатка для хранения, эта процедура должна быть приравнена к ликвидации данной пробы, об этом необходимо уведомить руководство и сделать всё возможное, чтобы применить для анализа методы, требующие меньшее количество образца.
Все биологические пробы, находящиеся в депозитарии, обязательно должны проходить контрольную проверку через установленные интервалы времени. Результаты тестирования должны быть обязательно отражены в паспорте образца. Если хранение биологических образцов осуществляется в холодильных установках, необходимо чтобы данное помещение было оборудовано системой отвода тепла от компрессоров холодильных установок (например, кондиционерами).
Помещение для хранения образцов проб крови
ДНК в образцах проб крови (как ядерная, так и митохондриальная фракции) при правильном осуществлении процесса забора крови, транспортировки и хранении может храниться довольно долго (не менее 6 месяцев в высушенном виде на марле или бинтах до нескольких лет на FTA-картах). Общее требование к помещению для хранения образцов проб крови: это должно быть отдельное непроходное помещение с моющимися поверхностями, необходимо обес-
