Мультисубстратное тестирование природных микробных сообществ - Горленко М.В.
ISBN 5-317-01228-7
Скачать (прямая ссылка):
суспензиями после предварительной концентрации клеток до 108-109 кл/мл.
Это не только повышает экспрессность метода, но и может снять
принципиальные ограничения МСТ как культурального метода: в этом случае
вообще нет необходимости в росте микробных популяций в ячейках. Последнее
обстоятельство может позволить регистрировать функциональный отклик и
некультивируемых форм бактерий. Среди других факторов, влияющих на ход
формирования СПС, относительно детально изучено значение температуры
инкубации. На примере различных типов модельных микробных сообществ
показано, что в интервале от +17 до +32°С этот фактор оказывает слабое
влияние на особенности СПС (Haack et. al., 1995).
При анализе СПС обычно выделяют три базовых параметра:
1) среднюю оптическую плотность в данный момент времени;
2) разнообразие откликов (степеней развития окраски) СПС;
3) общую структуру СПС в целом. Наиболее универсальным является третий
параметр, но другие также полезны при решении разнообразных задач
(Garland et al., 1997; Garland, 1998).
1 7
^1
Метод мультисубстратного тестирования (МСТ), таким образом, оказался
незаменимым инструментом для функционального описания микробных
сообществ, что в сочетании с традиционными методами почвенной
микробиологии позволяет дать интегральное структурнофункциональное
описание почвенного микробного комплекса. Доказана возможность применения
МСТ для определения функциональных характеристик микробных сообществ почв
и ризосферы, что позволяет развить в почвенной микробиологии особое
направление -"физиология сообществ" (Горленко, 1995).
К несомненным достоинствам метода МСТ можно отнести простоту в проведении
эксперимента, высокую чувствительность, хорошую воспроизводимость при
исследовании большого числа образцов, возможность строгого
математического сравнения его данных с данными других методов изучения
микробных сообществ. Возможность модификации МСТ путем варьирования числа
субстратов также является достоинством. Важным преимуществом технологи
МСТ является обработка данных методами многомерного анализа. Современное
развитие компьютерных технологий позволяет обрабатывать данные
максимально эффективно. Еще одним положительным качеством разработанного
метода является его экспрессность, что особенно важно для решения
прикладных задач по исследованию загрязнений окружающей среды.
Среди относительных ограничений МСТ помимо чисто методических проблем,
связанных, в частности, с фактором исходной численности микроорганизмов и
дифференциацией структурных и функциональных составляющих отклика
(Garland et al, 1997), отметим следующие.
Пожалуй, наиболее существенным пробелом в данное время представляется
отсутствие простой общей теории, понятной широкому кругу микробиологов.
Подобная ситуация связана прежде всего со сложностью функционирования
микробного комплекса в крайне гетерогенной системе, которой является
почва. Остается, в частности, неясной точная причина появления
выраженного отклика микробного сообщества на тот или иной субстрат.
Возможно, что регистрация отклика в текущий момент времени
свидетельствует о появлении
1 8
данного субстрата in situ в некоторый момент в прошлом. Понятно также,
что с помощью МСТ регистрируется реакция не всего почвенного микробного
сообщества, а его части, но даже для этой части неизвестной остается роль
межпопуляционных взаимоотношений в ячейках с ресурсами.
Серьезной проблемой, как это не парадоксально, может быть и высокая
чувствительность метода, если не выполнены требования о стандартизации
процедур предварительной подготовки и хранения почвенных образцов.
Предпочтительным является анализ свежеотобранных проб. При хранении в
холодильнике при +4° С уже через месяц регистрируется существенное
трансформация СПС с увеличением потребления органических кислот, фенолов
и аминов. Более приемлемым является замораживание образцов, но в этом
случае анализ желательно дополнить кинетическим подходом (Gobema et al.,
2005).
Существуют также и другие проблемы в интерпретации функционального
спектра сообществ. Дискуссионным остается вопрос о том, какая именно
информация (структурная или функциональная) представлена в многомерных
массивах данных. На основе экспериментов с модельными микробными
сообществами с помощью системы BIOLOG было сделано предположение о
преимущественно структурной характеристике сообществ (Garland et al.,
1997). Этот вопрос требует дополнительного изучения (Lehman at al.,
1997), поскольку многие ресурсы из набора МСТ имеют экологическую
значимость и представлены в разнообразных природных местообитаниях.
Например, для дифференциации микробных сообществ почв пастбищ (клевер) и
хвойных лесов достаточным оказался набор ресурсов, представленный
аргинином, аспарагином, Цитратом, глюкозой, серином (корневые выделения)
и мочевой кислоты (жизнедеятельность животных) (Stevenson et al., 2004).
В ряде случаев предварительный подбор ресурсов дает более четкую
