Мультисубстратное тестирование природных микробных сообществ - Горленко М.В.
ISBN 5-317-01228-7
Скачать (прямая ссылка):
включая таксономические определения на уровне чистых культур. Между
системами BIOLOG и ЭКОЛОГ есть ряд существенных различий:
1) Число ресурсов в основных наборах составляет 47 и 95 субстратов для
систем ЭКОЛОГ и BIOLOG соответственно.
2) Набор субстратов, используемых в системе ЭКОЛОГ, выбран с учетом их
информативности для решения разнообразных экологических задач на уровне
почвенных микробных сообществ. Неудивительно поэтому, что исследователи,
использующие набор GN системы BIOLOG в экологии, после демонстрации
возможностей отечественной системы ЭКОЛОГ (Gorlenko et al., 1997) пришли
к выводу о необходимости ревизии и сокращения фирменного набора
субстратов (Insam, 1997). В результате, для решения экологических задач
фирма BIOLOG в настоящее время выпустила на рынок новый набор
1 1
субстратов EcoPlates(tm).
3) Кроме единственного органического субстрата, обязательным компонентом
в каждой ячейке BIOLOG является пептон, отсутствующий в МСТ.
4) При использовании BIOLOG для решения задач таксономической
идентификации, учет потребления субстратов проводится качественно, а в
МСТ вводится количественная оценка интенсивности потребления.
Проведение анализа
Отбор и приготовление почвенных проб для МСТ обычно проводится по
следующей схеме (рис.2):
Пробы почвы отбираются почвенным микробуром, из расчета 10 субпроб с 1
м2. Образцы до анализа могут храниться 3 мес. в холодильнике, в состоянии
естественной влажности или в воздушносухом состоянии. Перед анализом
почву измельчают, перемешивают, просеивают через сито (2 мм) и отбирают
смешанный образец массой 2 г.
В стаканчик с навеской почвы помещают 100 мл фосфатного буфера (pH 6,5).
После этого содержимое стаканчика обрабатывается ультразвуком (УЗДН-1, 22
кГц, 0,04 А, 30 секунд). Столь же эффективной является, по нашим данным,
предварительная подготовка на лабораторном встряхивателе типа "ВОРТЭКС"
(3400 об/мин). Затем следует отобрать из полученной суспензии около 40 мл
в центрифужные пробирки и отцентрифугировать (ЦУМ-8, 2000 об/мин, 2
минуты).
Отобрать 20 мл. супернатанта в кювету дозатора (или крышку чашки Петри) и
добавить 2 мл раствора ТТБ. Тщательно перемешать полученную суспензию
покачиванием кюветы и 2-3 циклами "набор-выливание" многоканальным
дозатором типа ППМ-8.
Раскапать в чашку для МСТ содержимое кюветы дозатором ППМ-8 с
одноразовыми сменными наконечниками, установленным на розлив 200 мкл.
После раскапывания образца, заполненную чашку накрыть крышкой и
инкубировать в термостате при t=+28°C.
Планшеты с суспензиями инкубируют до появления визуально
1 2
Рис 2. Схема проведения анализа в системе ЭКОЛОГ (худ. С. С.Камаева).
1 3
регистрируемой окраски ячеек от 12 до 72 часов, в зависимости от
особенностей образца и целей исследования. В течение инкубационного
периода происходит развитие микроорганизмов в ячейках с восстановлением
трифенилтетразолия в формазан, придающий среде в ячейке красное
окрашивание. Концентрация формазана и обусловленная им оптическая
плотность ячейки определяются обилием и активностью микроорганизмов.
Массив данных фотометрического измерения значений оптической плотности по
всем ячейкам (всем субстратам) представляет собой спектр потребления
субстратов (СПС) для данного почвенного микробного комплекса.
После окончания инкубации осуществляется регистрация данных МСТ
программно-аппаратным комплексом ЭКОЛОГ. Считывание происходит
автоматически и не требует квалифицированного персонала. Оптическая
плотность ячеек чашки в диапазоне 510 нм считывается при помощи чашечного
спектрофотометра (анализатора иммуноферментных реакций "Униплан" АИФР-01)
и сохраняется программой ЭКОЛОГ в виде файла базы данных формата mdb. При
этом интенсивность потребления субстратов (окраска каждой ячейки)
представлена значением в диапазоне от 0 до 3000. Сохраняется также
название образца, его порядковый номер и время измерения.
Возможности, ограничения, решенные и нерешенные проблемы
МСТ
Несмотря на то, что МСТ уже становится одним из основных методов экологии
микроорганизмов, необходимо указать и на некоторые проблемы и особенности
его применения. Прежде всего, следует упомянуть возможность критики
метода на том основании, что у МСТ отсутствует теория. На самом деле,
можно сказать, что теория метода связана с аппаратом мощного многомерного
математического анализа СПС и парадигмой биоразнообразия. Вместе с тем,
предстоит серьезная работа для понимания биологического смысла
математических выводов.
СПС является интегральной многомерной характеристикой
1 4
микробных сообществ, которая специфически отражает различия в их
состоянии, и позволяет дифференцировать сообщества разных местообитаний
или разные состояния одного и того же сообщества, а также производить их
идентификацию. Метод эффективен для описания пространственной и временной
динамики микробных сообществ.
Однако, при этом регистрируется отклик не всего микробного сообщества, а
