Мультисубстратное тестирование природных микробных сообществ - Горленко М.В.
ISBN 5-317-01228-7
Скачать (прямая ссылка):
свидетельствует об очень высокой динамичности пула данных ресурсов
(характерные времена - часы), что может быть связано с активностью именно
почвенных микроорганизмов. Высокие скорости микробной утилизации
позволяют с достаточным основанием предполагать существенный вклад пула
легкодоступных ресурсов в поток СОг Таким образом, информация, полученная
методом МСТ, имеет непосредственное отношение к ключевой экологической
задаче - исследованию цикла углерода и других биогенных элементов.
В чашках "Эколог" субстрат и минеральные компонента находятся в сухом
виде и растворяются при добавлении исследуемой суспензии, приготовленной
на фосфатном буфере с pH 6,5. В каждую ячейку
7
Таблица 1.
Набор субстратов для мультисубстратного тестирования "Эколог".
Номинальные группы субстратов Субстраты
Сахара Ксилоза Ь-(+)-Рамноза
б-Лактоза Маннитоза
Ь-(+)-Арабиноза Пуллулан
D-(+)-Фруктоза Раффиноза
Б-(+)-Мальтоза Рибоза
Б-(+)-Глюкоза Сахароза
Спирты Глицерин Б-(-)-Маннит
Дульцит т-Инозит D-(+)-Cop6nT
Соли органических кислот Аспартат Ацетат
Цитрат Октаноат
Малеиннат Пропионат
D,L- Лактат Валерианат Сукцинат
Аминокислоты, амины, амиды, Аланин Мочевина
Нуклеозиды Аргинин Норвалин
Аспарагин Норлейцин
Ц,Ь-Валин Пролин
Г истидин Серии
Глицин Тимидин
L-Глутамин Треонин
Креатин L-Фенилаланин
Лизин L-Цистеин
Полимеры Декстран-500 Крахмал Твин-80
8
добавляют 0,2 мл почвенной суспензии после ультразвуковой обработки и
центрифугирования. Микроюоветы инкубируют 48-72 часа при температуре
28°С. Проявившаяся окраска пропорциональна интенсивности потребления
находящегося в ячейке субстрата. Степень окрашенности каждой ячейки
сравнивают с аналогичным показателем контрольной ячейки, не содержащей
субстрата. Для окончательного выражения окрашенности ячейки часто
используется такой нормированный показатель как средняя окраска ячейки:
D=(C-R)/[(C-R)]/N, где С - выраженная в показаниях прибора окраска данной
ячейки; R - то же для контрольной ячейки; N - число окрашенных ячеек.
Полученные в результате анализа данные представляют собой 47-мерный
массив, обработка которого ведется методами многомерной статистики
(факторный анализ, компонентный анализ, кластерный анализ и др.). Следует
отметить, что МСТ позволяет решать как задачи функциональной
характеристики микробного сообщества, так и осуществлять традиционное
структурное описание с таксономической характеристикой предварительно
выделенных чистых культур (рис.1). В последнем случае исследователь
должен иметь в своем распоряжении соответствующую базу данных. Такой
подход, разумеется, представляется эффективным в популяционных
диагностических задачах, когда речь идет об определении конкретных
желательных и нежелательных микроорганизмах. Однако далее нас будет в
основном интересовать более сложный анализ функционального потенциала
естественных микробных сообществ, когда многомерные СПС выступают в
качестве своеобразного "отпечатка пальца" сообщества.
Особенности двух основных методов МСТ
Впервые СПС микробных сообществ получили Гарланд и Миллс в 1991 году
(Garland, Mills, 1991). Они использовали для этого стандартную систему
BIOLOG, изначально предназначенную для экспресс-определения
таксономической принадлежности чистых культур, которое проводится путем
сравнения СПС анализируемой культуры с СПС эталонных культур в базе
данных. Фирма BIOLOG производили продает разные индикационные наборы
субстратов для таксономического определения грамм-отрицательных (GN),
грамм-положительных (GP)
9
Рис. 1. Функциональное (слева) и структурное (справа) описание природных
микробных сообществ с помощью МСТ.
1 О
бактерий, а также актиномицетов и дрожжей. Наибольшее распространение в
экологическом приложении BIOLOG получили стандартные наборы GN-
модификации.
В первой же своей работе по МСТ Гарланд и Миллс на основе системы BIOLOG
показали эффективность метода и его возможности для характеристики и
классификации ряда микробных сообществ почв, природных вод и ризосферы, а
также предложили основные подходы к интерпретации полученных данных
методами многомерной статистики. В настоящее время число публикаций по
применению в экологии микроорганизмов системы BIOLOG превышает 1500,
причем более 80% статей посвящены различным проблемам почвенной
микробиологии (методология, сравнение с другими методами, ризосферные
эффекты, индикация загрязнений, мониторинг, микробные сукцессии,
интенсивное и "биологическое" земледелие, последствия интродукции
объектов генной инженерии и др.).
Отечественная система ЭКОЛОГ разработана в 1993 году (Горленко, Кожевин,
1994), причем с самого начала упор был сделан на целевое применение
данной системы МСТ для решения разнообразных теоретических и прикладных
экологических задач на уровне сложных природных микробных сообществ почв
и других естественных местообитаний. Разумеется, при наличии необходимых
баз данных метод может использоваться и для решения более простых задач,
