Заболевание парадонта - Грудянов А.И.
ISBN 978-5-9986-0002-9
Скачать (прямая ссылка):
Четвертый метод — простая визуальная детекция роста проверяемого микроорганизма в присутствии субстрата: размножающиеся клетки вызывают помутнение среды в ячейке. Эта реакция также длительная и требует не менее 10 ч.
Пятый метод идентификации — хроматография конечных продуктов метаболизма жирных кислот — используется не очень широко, но отличается большей информативностью и меньшим временем анализа по сравнению с остальными методами. Основан он на том, что крупные группы микроорганизмов отличаются друг от друга характерным набором фосфолипидов клеточной мембраны. Недостатком данного метода является то, что нельзя идентифицировать роды и виды микроорганизмов.
Проточная цитометрия
Проточная цитометрия — метод быстрого оптического анализа отдельно взятых клеток. Последние проходят в струе жидкости через лазерный луч (лазерный диод, лампу с электрической дугой), свет рассеивается и по степени его рассеяния можно определить 5—10 различных параметров клетки: размер, содержание белков, ДНК, липидов, антигенные свойства, активность ферментов и т. п. — это позволяет в итоге идентифицировать клетки и подсчитывать их количество. В ходе анализа учитывается уровень флюоресценции химических соединений, входящих в состав клеточной стенки (автофлюоресценция) или внесенных в образец перед проведением проточной цитометрии. В отличие от обычной цитометрии метод позволяет исследовать тысячи и сотни тысяч клеток, проводить их достоверный учет, выявлять степень гетерогенности популяции, что не всегда можно достичь другими методами.
В настоящее время проточная цитометрия используется в клинике для выявления и подсчета собственных клеток и клеток бактерий и грибов в биологических жидкостях организма человека. Чувствительность метода можно повысить с помощью флюоресцентно меченных моноклональных антител к клеткам микроорганизмов.
Глава 3. Методы диагностики заболеваний пародонта
87
С помощью проточной цитометрии можно не только выявлять инфицирование микроорганизмами, но и определять спектр их чувствительности, причем длительность исследования не превышает нескольких часов. Подвергнутые воздействию антибиотиков (in vivo или in vitro) микроорганизмы сравнивают с контрольными образцами того же штамма для установления их жизнеспособности, а также изменений в нуклеиновых кислотах, белках, оболочке клеток и т. п., что позволяет оценить как степень эффекта антибиотика, так и точку приложения его действия. Выживаемость клеток после определенного физического или фармакологического воздействия определяется с помощью различных флюоресцентных красителей.
Таким образом, проточная цитометрия обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционными методами микробиологических исследований. Появление в последние годы в свободной продаже специальных наборов для выявления целого ряда микроорганизмов позволило значительно расширить диагностические возможности проточной цитометрии. Тем не менее вопрос стандартизации метода и адекватной интерпретации его результатов остается актуальным до сих пор.
Метод капиллярного электрофореза
Капиллярный электрофорез — относительно новый метод идентификации микроорганизмов Он основан на разделении одиночных клеток в электрическом поле в соответствии с их поверхностным зарядом. Этот заряд формируется за счет ионизации основных или кислотных группировок (карбокси-, амино-, органофосфатных групп, иногда сульфатных) на поверхности клетки, зависит от свойств клетки: ее типа, возраста, физиологических условий — и может изменяться после дифференцировки, обработки антибиотиками, химическими веществами.
Клеточная стенка грамотрицательных микробов состоит из трех слоев: бислой липидов, тонкий слой пептидогликанов, внешний двойной слой, покрытый липополисахаридами. Последние и формируют заряд грамотрицательных микроорганизмов. Грамположительные микробы имеют на поверхности толстый слой пептидогликанов, в составе которых преобладает тейхоевая кислота, за счет нее формируется отрицательный заряд. Вирусы имеют внешний белковый слой на мембране. Остатки аминокислот также способны заряжаться. Мембраны и клеточная стенка грибов содержат белки и липидные молекулы, придающие им характеристический заряд в зависимости от pH, вида ионов, состава электролитов и температуры. При этом многие бактерии могут соединяться в цепочки и кластеры, что тоже будет выявлено их движением в электрическом поле. Клетки легко можно сделать видимыми, окрашивая их флюоресцентными красителями.
Капиллярный электрофорез — быстрый, с высокой разрешающей способностью метод с минимальной подготовкой образца. Недостатками метода являются требовательность в подготовке образцов клеток к анализу, поскольку уже небольшое изменение pH, концентрации ионов, кислорода приводит к изменению заряда и невоспроизводимым результатам, и небольшое количество клеток, которые можно анализировать одновременно, — от 3 до 15 [ 18].
Иммунохимическое исследование
Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами, вошли в ана-
