Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
h" — изменение показаний манометра,
k\ и k"co, — соответствующие константы сосудика.
(8.5>
258 Часть III. Аналитические методы
h' kco — h" krn XCt =*---------_??t-------_CQ,— 6)
*~co1 ^
(_^cOj_ _ _^co ko, ko.
Так как k'ot, k'co,, k"ot и ft "со, известны, ah' и h" измеряются экспериментально, из уравнения (8.6) можно вычислить Хо,- При известном Хог по уравнению (8.5) можно рассчитать -Хсо,-
Метод Диккенса и Саймера. В этом методе как поглощение кислорода, так и общее выделение углекислоты определяются в одном и том же манометрическом сосудике. Потребление кислорода определяют обычным способом, поглощая двуокись углерода щелочью. В конце эксперимента связанную двуокись углерода высвобождают, добавляя к щелочи сильную кислоту. Результирующее изменение показаний манометра соответствует суммарному количеству углекислоты (нужно обязательно учитывать поправку на тепло, выделяющееся при реакции нейтрализации). Количество исходно присутствующей углекислоты определяют с помощью второго, идентичного первому, сосудика, в котором кислоту добавляют до лачала эксперимента.
Метод Парди. Этот метод основан на ином способе определения .поглощения кислорода в присутствии двуокиси углерода. В центральный цилиндрик вместо щелочи помещают углекислый буфер. Этот буфер, способный поддерживать постоянное напряжение двуокиси углерода в газовой фазе, состоит из водного раствора ди-этаноламина, который обратимо связывает двуокись углерода:
NH(CH2CH2OH)t -f- СОа+ Н20 ^ HCOf + +NH|(CH2CH2OH)1.
8.6.4. Определение коэффициентов обмена (метаболических коэффициентов)
Для определения метаболических коэффициентов изучают обмен кислорода и (или) углекислого газа на протяжении некоторого времени. Скорость газообмена непостоянна; она определяется по экспериментальной кривой зависимости объема обмениваемого газа от времени как тангенс угла наклона касательной к любой точке этой кривой. Отсюда, зная количество взятого биологического материала, можно рассчитать коэффициент обмена.
$.6.5. Исследование митохондрий
Манометрию довольно широко применяют при изучении действия различных ингибиторов дыхания. Чаще всего в роли ингибитора выступает цианид; он легко проникает в клетки и ингибирует
Гл. 8. Манометрические методы 259
определенные ферменты дыхательной цепи, а следовательно, и процесс окислительного фосфорилирования. Синильная кислота является слабой кислотой, и при растворении ее солей в воде образуется преимущественно недиссоциирующая кислота, обладающая летучестью и легко поглощаемая щелочью одновременно с двуокисью углерода. В связи с этим эффективная концентрация цианида в процессе эксперимента изменяется. Во избежание этого в случае необходимости создают постоянное напряжение цианистого водорода с помощью смеси цианида кальция и гидроокиси кальция. Изучение дыхательного контроля и действия различных ингибиторов на дыхание митохондрий, а также измерение отношения Р/О [фосфата (Ф), включаемого в АТФ в расчете на каждый атом потребленного кислорода (О)] лучше всего проводить с помощью более чувствительного кислородного электрода (разд. 7.8).
8.6.6. Изучение фотосинтеза
Скорость газообмена водорослей и хлоропластов в ходе фотосинтеза можно легко определить манометрически. Как правило» при этом проводят контрольные опыты в темноте. Парциальное давление одного из газов в ходе эксперимента необходимо поддерживать на постоянном уровне. Для этого можно воспользоваться карбонат-бикарбонатными буферами, поддерживая с их помощью постоянным парциальное давление двуокиси углерода (метод Пар-ди, разд. 8.6.3), или полностью устраняя весь кислород химическим способом. Ценность таких исследований, однако, ограничена, так как известно, что скорость фотосинтетического обмена двуокиси углерода зависит от содержания кислорода в атмосфере.
8.7. Рекомендуемая литература
Sestak Z., Catsky J., Jarvis P. G., Plant Photosynthetic Production — Manuat of Methods, Junk, The Hague, 1971. (Подробно рассмотрена манометрия по Варбургу и Джилсону и применение кислородного электрода для изучения фотосинтеза.)
Umbreit W. W., Burris R. Н., Stauffer J. F., Monometric in Biochemical' Thechniques, 5th end, Burgess Publishing Company, Minneapolis, 1972. (Наиболее доступное руководство по манометрическим методам.)
Дополнительная литература
Умбрейт В. В. и др., Манометрические методы изучения тканевого обмена, пер. с англ., ИЛ., М., 1951.
ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
Автолиз 40
„Авторадиография 29, 30, 127, 205, 210
Агар 115, 119, 122, 123, 133, 134, 137
Агароза 93, 95 Адсорбенты 70, 71 Акриламид, мономер 95, 123
— N, N'-метиленди-123
— полимеры 93, 95, 123, 124 Альфа-частицы 186 Аминокислотный анализатор 91 Аминокислоты, анализ 152
— влияние pH на свойства 21, 22, 118
— ГЖХ (газожидкостная хроматография) 73
— ионообменная хроматография 75
