Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Манометрическими методами можно изучать срезы и гомогенаты растительных тканей, равно как корневые чехлики и семена. Если объектом исследования являются листья, следует помнить, что в них наравне с дыханием может происходить и фотосинтез.
8.6.3. Определение дыхательных коэффициентов
'Для определения дыхательного коэффициента живых клеток необходимо одновременно измерять поглощение кислорода и выделение углекислого газа. Для этих целей подходят четыре основных манометрических метода.
«Прямой» метод Варбурга. При этом методе используют два реакционных сосудика, в одном из которых (в центральном цилиндрике) имеется щелочь для поглощения двуокиси углерода, и, следовательно, регистрируется потребление кислорода, а в другом щелочь отсутствует, т. е. регистрируется баланс между поглощением кислорода и выделением двуокиси углерода. При использовании респирометра Джилсона последующие расчеты дыхательного коэффициента не представляют сложностей; при манометрии по методу Варбурга расчет количества выделившейся двуокисй углерода проводят следующим образом.
Сосудик 1 (с КОН).
Изменение объема обусловлено поглощением кислорода. Если константы сосудика для 02 и С02 обозначить как k'ot и k'co, соответственно, то
где h' — изменение показаний манометра, - Хо, — объем утилизированного кислорода.
Сосудик 2 (без КОН).
Изменение объема определяется соотношением между объемами поглощенного 02 и выделившегося С02. Если обозначить константы сосудика как k”o, и &"со„ а наблюдаемые изменения показаний через /г", то
Отсюда
Люлн ~~ ^о, + ^со,
(8.3)
256 Часть III. Аналитические методы
ИЛИ
*co, = fA"-------
^Следует помнить, что суммарные изменения объема газа и соответствующие им показания манометра принято считать отрицательными, т. е. h' отрицательна и отрицательной может быть и h". Для иллюстрации рассмотрим следующий конкретный пример. Пример.
Равные навески срезов тканей печени крысы в буферном растворе поместили в два сосудика Варбурга. В центральный цилиндрик сосудика 1, имеющего константу для кислорода 1,77, добавили щелочь. Константы сосудика 2 для двуокиси углерода и кислорода составляют соответственно 1,86 и 1,42. Показания манометра в начальный момент времени и через 20 мин, а также показания тер>-мобарометра приводятся ниже:
Время Тремобарометр Сосудик 1 Сосудик 2
(мин) (мм манометрической жидкости)
0 150,0 236,0 160,0
20 149,7 216,2 153,9
Сосудик 1
Изменение показаний манометра —19,8 мм
Изменение показаний термобарометра —0,3 мм
Скорректированное изменение показаний манометра —19,5 мм
Объем поглощенного кислорода = 19,5 X 1,77 мм3 = 34,5 мм3
Сосудик 2
Изменение показаний манометра —6,1 мм
Скорректированное изменение показаний манометра —5,8 мм
Объем выделившегося СОа [согласно уравнению (8.3)] =
= [-в.в—(=^)] ьве мм- -
= (—5,8 + 24,3) 1,86 мм® =
¦= 18,5X1,86 мм* = 34,4 мм8
К<3“1ЙТ = 1,0
Так как субстрата не добавляли, то обмен в ткани печени происходил с использованием эндогенных резервов; судя по величине RQ, субстратом обмена был, вероятно, гликоген.
Недостатком этого «прямого» метода Варбурга является то, что полное удаление двуокиси углерода из газовой фазы создает нефизиологические условия, в результате чего может измениться процесс дыхания биологического материала. Такого недостатка лишены «косвенный» метод Варбурга и метод Парди.
Гл. 8. Манометрические методы 25Т
«Косвенный» метод Варбурга. Метод основан на том, что изменения объема двух газов с заметно различающейся растворимостью (например, Ог и СОг) измеряют одновременно, снимая показания манометров для идентичных реакционных смесей (имеются! в виду равные навески тканей) в двух сосудиках, значительно отличающихся один от другого по объему жидкости или газа.
Обычно в сосудике 1 отношение объема буфера к объему газа; составляет примерно 1:3, а в сосудике 2 — 2:1. Так как навески ткани в обоих сосудиках равны, предполагается, что реакции в-обоих сосудиках можно сопоставлять.
Поскольку С02 теперь не поглощается, справедливо уравнение (8.3), т. е.
*Это уравнение применимо к обоим сосудикам.
Сосудик 1
Ь! — изменение показаний манометра,. k'o, и /г'со, — константы сосудика для Ог и СОг соответственно.
Таким образом, мы имеем:
Вследствие идентичности реакций, протекающих в каждом сосудике, количества поглощенного кислорода (Хо,) и выделившейся двуокиси углерода (XcoJ должны быть в обоих случаях одинаковыми.
Приравняв правые части уравнений (8.4) и (8.5), получим.
(8.4).
Сосудик 2
