Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
промежуточные редокс-реакции, и попытаемся обрисовать основные моменты,
на которые следует обращать внимание при конструировании таких приборов.
Для иллюстрации этих принципов ниже приведены предварительные данные по
глюкозным и спиртовым сенсорам.
17.1.2. Перенос электронов в ферментных и клеточных системах
Между механизмами генерации сигнала целыми клетками и в медиаторных
ферментных электродах (последние обсуждаются в гл. 12 и 15 настоящей
книги) имеются принципиальные различия. В последнем случае электроны
отбираются от восстановленных ферментов на донорном сайте (или
ограниченном числе сайтов) при условии относительно свободного доступа к
медиатору. Доступ медиатора к восстановителям в организме естественно
ограничивается клеточными стенками и мембранами, к тому же число и
расположение восстанавливающих частиц (ферменты, пиридиновые нуклеотиды,
хиноидные интермедиаты, цитохромы) могут меняться. В принципе медиатор
может взаимодействовать с каким-то специфическим внутриклеточным донором
электрона, но поскольку в системе присутствуют сложные взаимодействующие
редокс-частицы, во многих случаях удобно считать, что электроны образуют
своего рода "восстановительный пул" в цитоплазме. Некоторые из факторов,
которые следует учитывать в этих системах, имеют также непосредственное
отношение к сенсорным приложениям электрохимии белков и переносу
электронов на цитохромные центры и из них, рассмотренным в недавних
обзорах [13, 50].
17.2. Клетки как катализаторы в биосенсорах
Поскольку большинство ферментов, применяемых в биосенсорах, выделяют из
микроорганизмов, вполне логично рассматривать и сами микроорганизмы как
потенциальные биокатализаторы, даже если манипулирование с ними создает
ряд проблем
[2]. Для использования в сенсорах микроорганизмы можно направленно
отбирать из доступного нам огромного их числа (аэробные, анаэробные,
хемолитотрофные, фото-синтетические микроорганизмы и т. д.), поскольку
они сильно различаются по физиологии дыхания и своей биохимии. Четких
руководств по выбору таких микроорганизмов не имеется. Здесь приходится
пользоваться тем, что известно о приложениях ферментов, и опытом
многочисленных более ранних исследований по непрямым микробным сенсорам.
Направления будущей работы с микроорганизмами во многом определяются
рядом отчетливых достоинств и недостатков микроорганизмов как
биокатализаторов:
а) Изменчивость микроорганизмов очень велика, и в принципе они могут
служить биокатализаторами для широкого круга представляющих аналитический
интерес субстратов. Этот круг охватывает почти все типы природных
соединений углерода
[24].
б) Стоимость производства многих микроорганизмов не слишком велика, тогда
как выделение фермента из его источника может обходиться дорого.
240
Глава 17
в) В тех случаях, когда окисление в клетках включает несколько стадий
разложения субстрата с образованием восстанавливающихся интермедиатов,
электрохимический сигнал целых клеток может быть выше, чем в случае
изолированного фермента. Так, в одном из типов глюкозного сенсора при
окислении глюкозы в глюконолактон с помощью глюкозооксидазы выделяется
два электрона на молекулу субстрата [14]:
С6Н12Оь = глюконолактон + 2Н+ + 2е~.
В то же время полное окисление глюкозы в живой клетке можно представить
уравнением
С6Н12<Э6 + 6Н2<Э = 6С<Э2 + 24Н+ + 24е~.
На практике можно добиться почти такого же большого выхода электронов
[18]. Следует, однако, отметить, что микробные катализаторы имеют больший
объем, чем ферментные, и по оценкам в биотопливных элементах
относительная активность клеток некоторой заданной массы примерно равна
активности той же массы фермента, которая содержится в этих клетках.
г) Некоторые потенциально пригодные для биосенсоров ферменты неустойчивы
или требуют для своего функционирования либо гидрофобного окружения, либо
сложных методов иммобилизации. В микроорганизмах устойчивость и
активность ферментов обеспечивается естественной внутриклеточной средой,
которую трудно имитировать, а способы иммобилизации клеток довольно
просты [23, 29].
д) В микроорганизмах ферменты лучше защищены от мешающих (генерирующих
сигнал) или ингибирующих растворенных веществ, например соединений
тяжелых металлов, имеющихся во многих исследуемых образцах.
е) Для ферментативного биоэлекгрохимического переноса электронов часто
необходимы коферменты. Однако при использовании микроорганизмов не
требуется вводить экзогенные кофакторы, поскольку эти вещества
регенерируются в клетках.
ж) Многие микроорганизмы подробно охарактеризованы генетически, а методы
селекции штаммов с высоким выходом определенных ферментов достаточно
отработаны. Разумное использование мутации позволяет дополнительно
увеличить активность, селективность и специфичность биосенсоров.
з) Как прямые, так и косвенные методы преобразования сигнала целых клеток
открывают простор для негенетических биотехнологических манипуляций. В
частности, прямой метод гарантирует универсальность преобразования
