Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
ацетатный буферный раствор (100 мМ, pH 4,5), содержащий мето-и-
толуолсульфонат 1-циклогексил-3(2-морфолиноэтил)карбодиимида (100 мМ).
Затем электроды промывают дистиллированной водой и помещают на ночь в
раствор глюкозооксидазы (50 мг/мл белка на 1 мл) в ацетатном буферном
растворе (100 мМ, pH 4,5) или на час в карбонатный буферный раствор (100
мМ, pH 9,5) с тем же содержанием белка. После иммобилизации электроды
промывают и хранят замороженными при - 20 °С в фосфатном буферном
растворе (100 мМ, pH 7,4).
При постоянном потенциале + 150 мВ (относительно н. к. э.) и температуре
30 °С электродная функция линейна до концентрации глюкозы 30 мМ с
постоянной времени 30 с [9]. При низких концентрациях глюкозы (до 8,0 мМ)
сигнал сенсора не зависит от pH в диапазоне pH 7,0-9,0, хотя при высоких
концентрациях глюкозы такая зависимость наблюдается. С ростом температуры
до 45 °С ток электрода увеличивался со скоростью 4,0%/град, при более
высокой температуре происходит инактивация. Присутствие кислорода
вызывает уменьшение генерируемого тока, поскольку кислород является
естественным акцептором электрона для используемого фермента. Кажущаяся
константа Михаэлиса Км для окисления глюкозы при помощи иммобилизованной
этим способом глюкозооксидазы составляла 24 мМ. Поликарбонатная мембрана,
помещенная на датчик, не влияет на значение Км. Однако в случае диализной
мембраны Км повышается до 74 мМ. При этом отклик системы из кинетически
контролируемого становится диффузионно контролируемым, что можно
использовать для расширения диапазона линейности.
К числу достоинств электрода по сравнению с описанными выше системами
относится то, что он позволяет быстро и многократно проводить измерения в
растворах исследуемых образцов. Электрод легко градуировать, а при работе
с физиологическими концентрациями глюкозы его функция не зависит от pH,
что так характерно для растворенного фермента. Итак, по многим своим
характеристикам электрод удовлетворяет требованиям клинического анализа и
анализов in vitro. Использование микроманипуляторной техники в сочетании
с миниатюрными электродами, видимо, будет способствовать разработке
приборов этого типа для анализов in vivo.
234
Глава 16
16.4. Плоские приборы
Для медиаторных амперометрических биосенсоров характерны довольно низкие
токи, что позволяет упростить их электронную схему путем объединения
электрода сравнения и вспомогательного электрода в один противоэлектрод,
в качестве которого можно, например, использовать хлоридсеребряный
электрод сравнения. Двухэлектродная конфигурация позволяет монтировать
рабочий и противоэлектрод в непосредственной близости друг от друга на
подходящем основании, что позволяет уменьшить требуемый объем пробы.
Примером может служить плоский ферментный электрод, показанный на рис.
16.7. Хлоридсеребряный электрод из серебряной фольги (BDH Chemicals Ltd.,
Великобритания) полируют суспензией оксида алюминия (0,2 мкм; BDH
Chemicals Ltd.). Как и в описанных выше приборах с задаваемым
потенциалом, фольгу (размером 40 х 5,0 х 0,13 мм) связывают с внешней
цепью припаянной проволокой, изолированной с помощью непроводящей
эпоксидной смолы (Ciba-Geigy, Великобритания). Перед использованием
электрод погружают в раствор НС1 (1,0 М), выдерживают 30 с при потенциале
+400 мВ (относительно н. к. э.) и промывают дистиллированной водой. Перед
установкой в плоский прибор одну поверхность электрода полируют
суспензией оксида алюминия и разрезают на квадратики (3,0 х 3,0 мм).
Каждый такой квадратик приклеивают к основанию проводящей смолой с
серебряным наполнителем (фирмы Johnson Matthey Chemicals).
Квадратики папиекса (3,0 х 3,0 мм) прикрепляют к базовому электроду при
помощи коллоидного графита. Плотно прижав папиекс к электроду, удаляют
излишки графита. Фермент иммобилизуют так же, как описано выше. Перед
этим электрод сравнения изолируют слоем силиконовой резины, чтобы
исключить инактивацию фермента ионами серебра. Перед использованием
глюкозооксидазного электрода протектор из силиконовой резины удаляют.
16.5. Производственные соображения
Амперометрические ферментные электроды уже сейчас вполне пригодны для
использования в лабораторных условиях, хотя их разработка еще только
выходит из начальной стадии и на практике могут возникать различные
трудности. Они связаны прежде всего с необходимостью контроля химических
и физических условий, влияющих на каталитические реакции в сенсоре.
Мешающее влияние кислорода можно уменьшить, используя несамоокисляющиеся
медиаторы. Еще более радикально эта проблема решается с помощью
независимых от кислорода ферментов, например хинопро-
3
Рис. 16.7. Схематическое изображение плоского глюкозооксидазного
электрода. Оба электрода, рабочий и хлоридсеребряный, установлены
горизонтально на керамическом основании. Подробности см. в тексте. 1 -
хлоридсеребряный электрод сравнения; 2 - соединительная проводящая
дорожка; 3- контакты для подключения потещиостата; 4-изолирующий слой; 5-
