Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
должна удерживать фермент и в то же время пропускать низкомолекулярные
компоненты-газ, медиатор, субстрат. Ионообменные мембраны, как правило,
удовлетворяют этим требованиям, хотя их диффузионные свойства зависят от
pH буферного раствора [31]. На работу элемента влияет также изменение
скорости перемешивания раствора в анодном отделении
Медиаторные амперометрические биосенсоры
229
мембрана
Рис. 16.2. Схема биотопливного элемента на основе глюкозооксидазы:
MED[ol/red)- окисленная и восстановленная формы медиатора; GOD^xjred)-
окисленная и восстановленная простетическая группа фермента.
Рис. 16.3. Стационарный ток биотопливного элемента на основе
глюкозооксидазы, измеренный по падению напряжения на калиброванном
сопротивлении.
[ Гпюкоза\ , мМ
(перемешивание необходимо для ускорения переноса электрона с комплекса
фермент-медиатор на электрод). Диффузия компонентов через мембрану
приводит к снижению эффективности переноса электрона вследствие побочных
реакций. Из-за этих ограничений биотопливный элемент непригоден как
сенсор в большинстве случаев, где требуется количественное определение
субстрата.
16.2. Ячейки с задаваемым потенциалом
Функции воздушного катода и полупроницаемой мембраны в биотопливном
элементе может выполнять обычный или управляемый компьютером
потенциостат.
230
Глава 16
Это устройство поддерживает потенциал рабочего электрода
электрохимической ячейки на заданном уровне относительно электрода
сравнения, например каломельного.
Мешающее влияние кислорода можно уменьшить, используя независимый от
кислорода фермент, например метанолдегидрогеназу. Этот фермент способен
окислять первичные спирты до соответствующих альдегидов и кислот.
Введение метанол-дегидрогеназы в ячейку с фиксированным потенциалом
рабочего электрода, содержащую растворимый медиатор (этосульфат
феназина), позволяет определять метанол в концентрациях намного меньших,
чем это возможно в обычной газожидкостной хроматографии [3]. Основой
этого устройства (рис. 16.4) был реакционный сосуд с водяной рубашкой
вместимостью 5,0 мл (Quickfit, Gallenkamp and Co. Ltd., Великобритания),
термостатированный при 30 °С. Ячейку заполняли боратным буферным
раствором (3,0 мл, 250 мМ, pH 9,0), содержащим хлорид аммония (50 мМ),
этосульфат феназина (1,0 мМ) и неочищенный экстракт из Methylosinus
trichosporium (3,0 мг белка), выделяемый из микроорганизмов, растущих на
метане как единственном источнике углерода и энергии [25]. Реакционную
смесь непрерывно продували азотом и перемешивали с помощью магнитной
мешалки. Рабочий платиновый электрод очищали циклической катодно-анодной
обработкой, погружали в реакционную
Рис. 16.4. Схема ферментного сенсора с фиксированным потенциалом,
содержащего растворимые компоненты. Пояснения даны в тексте. 1 -
газообразный азот; 2-магнитная мешалка; 3-платиновый электрод-сетка; 4-
пробка из пористого стекла; 5-ввод пробы; 6 - платиновый противоэлектрод;
7-стандартный каломельный электрод сравнения.
Медиаторные амперометрические биосенсоры
231
смесь и поддерживали потенциал +100мВ с помощью потенциостата фирмы Н. В.
Thompson and Associates, Великобритания. Использовали платиновый противо-
электрод, изолированный от реакционной смеси пористым стеклом. Измеряя с
помощью вычислительного интегратора CDP4 (фирмы Pye Unicam Ltd.,
Великобритания) заряд, проходящий через систему при добавлении в нее
аликвоты анализируемого раствора, можно определять малые концентрации
формальдегида и метанола вплоть до 0,02 мкМ.
В качестве электрохимического сенсора эта ячейка имеет много преимуществ
перед описанным выше биотопливным элементом. Прежде всего в ней не
используется мембрана и не требуется продувание кислородом. Однако, как и
в случае био-топливного элемента, здесь имеет значение скорость
перемешивания, и в присутствии самоокисляющегося медиатора необходимо
поддерживать анаэробные условия. Альтернативным решением является
использование несамоокисляющегося медиатора, например ферроцена, который
эффективно переносит заряд независимо от давления кислорода. Ферроцен и
его производные представляют собой группу металлоорганических соединений,
способных переносить один электрон между оксидоредуктазами (такими, как
глюкозооксидаза, пируватоксидаза, ксантиноксидаза, оксалатоксидаза,
липоамиддегидрогеназа, глугатионредуктаза [8]) и хинопротеинами [14]
(например, метанолдегидрогеназой [3], глюкозодегидрогеназой [12] и
лактатдегидрогеназой
[23]). Введение в описанный выше метанольный сенсор растворимого
производного ферроцена, диметил-триметилферроценметиодата (1,0 мМ),
позволяет определять метанол в концентрациях до 3,0 мкМ независимо от
колебаний давления кислорода. В подтверждение этого измеряли ток пика и
проходящий заряд при продувании ячейки либо кислородом, либо азотом.
Описанный прибор не требует высококвалифицированного обслуживания и
дорогостоящего оборудования. Однако на его работу влияет интенсивность
