Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
Градиент плотности. Для создания градиента плотности обычно используют'
растворы сахарозы, хотя допустимо применение и несахарозных градиентов.
Идеальные составляющие градиен-
Рис. 2.1. Колонка объемом 110 мл, оснащенная платиновыми электродами, для
изоэлектрического фракционирования белков. Изображен модифицированный
вариант колонки, впервые описанной в работе Svensson, 1962b. ИЭФ белков
протекает в отсеке Б. А - рубашка охлаждения; 7а и 76 - вход и выход
охлаждающей жидкости. Один из электродов (5а, б), расположенный в верхней
части колонки, контактирует с рабочим раствором в отсеке Б. Образующийся
газ выходит через отверстие 6. Второй электрод (1а, б) расположен в
центральной трубке В; электродный раствор, заполняющий эту трубку, в
процессе ИЭФ контактирует с рабочим раствором в отсеке Б. Заглушка (3)
центральной трубки соединяется при помощи жесткого тефлонового стержня с
верхней головкой, в которой находится гнездо контакта (1а) с электродом
(16), укрепленным на стержне. Для того чтобы открыть центральную трубку,
заглушку (3) опускают вниз, переводя головку в нижнее положение и
закрепляя ее за крючок 2. Газ, образующийся на электроде 1, поднимается
по центральной трубке и выходит через отверстие 4. Перед опорожнением
колонки центральную трубку закрывают заглушкой 3, опуская крючок 2.
Нижняя часть колонки закрыта пробкой 8 с отверстием, к которому
присоединяется сливная трубка, ведущая к коллектору фракций (Vesterberg
et al., 1967).
7*
100
Глава 2
та должны очень хорошо растворяться в воде без образования ионов. Для
формирования градиента плотности с величиной инкремента не менее чем 0,12
г/см3 раствор должен иметь высокую плотность, но вместе с тем обладать
достаточно низкой вязкостью. Наконец, составляющие градиента не должны
реагировать с образцом и не должны мешать детектированию разделяемых
компонентов.
Для приготовления сахарозного градиента плотности рекомендуется -
использовать препараты сахарозы высшей степени очистки (analytical
grade). Требуемый градиент можно получить, исходя из двух растворов -
"легкого", содержащего только амфолиты и образец, и "тяжелого",
содержащего амфолиты, образец и сахарозу. Смешивая два этих раствора в
определенных соотношениях, можно получить серию растворов с нарастающей
плотностью. Эти растворы последовательно наслаивают на поверхность
тяжелого электродного раствора, помещенного в нижнюю камеру колонки.
Благодаря диффузии между слоями удается получить относительно плавный
градиент плотности. Другой, более воспроизводимый способ формирования
градиента плотности основан на применении смесителей градиента, таких,
как Ampholine gradient mixer LKB 8121 и LKB 8122, рассчитанных на
заполнение колонок объемом 110 и 440 мл соответственно. Применение
смесителей этого типа (Svensson, Pettersson, 1968) позволяет получать
линейные градиенты плотности исходя из равных объемов легкого и тяжелого
растворов, различающихся по плотности на 0,2 г/см3. Это различие в
плотностях соответствует концентрации сахарозы 5 и 50% в легком и тяжелом
растворах соответственно.
Для создания антиконвекционной среды могут быть использованы и другие
вещества, например сорбитол (Vesterberg, 1971) или глицерин (Vesterberg,
Berggren, 1966), особенно при ИЭФ в щелочном диапазоне, где может
происходить ионизация сахарозы. Можно использовать и этиленгликоль
(Ahlgren et al., 1967; Kostner et al., 1969), концентрация которого в
тяжелом растворе ввиду более низкой плотности должна быть порядка 60-70%.
В числе других возможных составляющих градиента стоит упомянуть маннитол
и полигликаны, такие, как декстран (Leise, Le Sane, 1974) и фиколл
(Sherbert et al., 1972; Sherbert, Lakshmi, 1973), поставляемые фирмой
Pharmacia. Смешанные градиенты на основе сахарозы и фиколла используют
для разделения клеток (Boltz, Todd, 1979), поскольку с помощью этих
компонентов можно создать изоосмотические условия (303 моем)' в диапазоне
плотностей от 1,035 до 1,055 г/см3. Для этого в колонке одновременно с
градиентом концентрации фиколла 1-10% создают обратный градиент
концентраций сахарозы от 7 до 5%.
Было описано также получение градиента плотности с по-
Препаративное ИЭФ
101
мощью тяжелой воды (Fredriksson, Pettersson, 1974; Fredriksson, 1975).
ИЭФ в градиенте D20 проводилось только в небольшой спектрофотометрической
ячейке объемом 1,5 мл (Jonsson et al., 1973); Градиенты этого типа
формировались непосредственно в ячейке за счет взаимной диффузии трех
растворов с различным содержанием D20 в течение 3 мин (Rilbe, Pettersson,
1968). Хотя полный инкремент плотности в градиенте D20 составляет лишь
0,1 г/см3, вязкость в нем (при б^С) примерно эдвое ниже, чем вязкость
водного раствора сахарозы с такой же плотностью. Это приводит к более
благоприятному распределению напряженности поля и уменьшению времени
фокусирования. Следует отметить, что при измерении pH в градиенте D20
получаются значения, завышенные по сравнению со значением pH в сахарозном
