Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
"псевдофокусирование" цитохрома с было обнаружено в работе Kolin, 1954, и
тоже объяснялось возникновением своего рода "ловушки" с нулевой
электропроводностью. В этой связи стоит вспомнить опыты по электролизу
Na2SC>4, которые проводились еще в начале 40-х годов Тизелиу-сом и
Свенссоном (Rilbe, 1976). Так, было обнаружено, что в результате
накопления H2SO4 у анода и NaOH у катода в средней части электролизера
возникала область скачкообразного изменения pH. Действительно, согласно
данным Pollack, 1979, присутствие всего лишь 1 мМ соли в католите или
анолите ока-
90
Глава 1
зывается достаточным, чтобы предотвратить "псевдофокусирб-вание" какого
бы то ни было белка. Таким образом, даже незначительное повышение ионной
силы среды позволяет белкам миновать вышеупомянутые "ловушки".
1.11.5. Градиенты pH, образуемые смесями кислот, оснований и амфолитов
Первые опыты, описанные в работе Pettersson, 1969, показали, что при
фокусировании смеси амфолитов и кислот можно получить градиент в
диапазоне pH 1-3. В этой работе использовали смесь шести кислот (№ 1, 2,
4, 6, 8 и 11 по табл. 1.7) и двух амфолитов - глутаминовой (pi 3,22) и
аспарагиновой (pi 2,98) кислот. Было показано, что при действии
электрического поля все компоненты распределяются в порядке возрастания
их рК. При этом самая сильная кислота подходит ближе всех к аноду. Самая
слабая кислота в той части своей зоны, которая ближе к аноду, практически
не ионизирована.
С помощью такого градиента pH было осуществлено фракционирование пепсина
(pi 2,5) и семи окрашенных компонентов (pi 1,3-3,1) из сока красной
свеклы. Следует отметить, что используемый градиент pH имел ступенчатую
форму. Аналогичный подход применялся в работе Stenman, Grasbeck, 1972,
для фракционирования белков, связывающих витамин В12. Для образования
градиента использовали смесь восьми кислот (№ 3, 5, 7-12 по табл. 1.7) и
тех же двух амфолитов. При фокусировании в глицериновом градиенте
плотности при 400 В в течение 5 сут удавалось получить квазистационарный
плавный градиент pH 1,5-4,5.
Недавно в серии публикаций группы Крамбаха (Nguyen, Chrambach, 1976;
Nguyen, Chrambach, 1977 a, b, с; Nguyen et al., 1977 a, b; Caspers,
Chrambach, 1977) было показано, что фокусирование можно аналогичным
образом проводить в нейтральной и основной областях pH. Авторы
использовали смеси неам-фотерных и амфотерных буферов, в том числе
аминокислот. С помощью этого метода, названного "буферным
электрофокусированием" (БЭФ), были исследованы особенности процессов
образования и разрушения градиента pH при ИЭФ и проведено сравнение двух
родственных методов разделения - ИЭФ и ИТФ. Полученные результаты можно
суммировать следующим образом.
1. Обнаружено, что неамфотерные буферные вещества, помещенные в
электрическое поле между кислым анолитом и щелочным католитом, могут
формировать стабильный градиент pH. Это означает, что фокусирование, по
сути дела, не является изоэлектрическим.
Теория и важнейшие аспекты ИЭФ
91
Таблица 1.7. Кислые и оснбвные буферы и амфолиты, используемые при БЭФ
(Righettl, 1979)
Кислоты РК Основания РК Амфолиты рК (аминогруппы)
Дихлоруксусная 1,48 Пиридин 5,5 MES 6,4
Фосфорная 2,12 4-Пиколин 6,2 ADA 6,6
Малоновая 2,18 Бис-трис 6,9 PIPES 6'8,
Монохлоруксус- 2,84 Лютидин 7,0 BES 7,15
иая
Молочная 3,08 Г идроксиэтилмор - 7,2 MOPS 7.2
3,08 фолин 7,5 7,3
Лимонная Имидазол 4.CES
Малеиновая 3,45 N-этилморфолин 8,0 HEPES 7,55
Муравьиная 3,75 Триэтаноламин 8,4 TES 8,0
Янтарная 4,16 Трис 8,8 Трицин 8,6
Глутаровая 4,34 Моноэтаноламин 10*4 Бицин 8,7
Уксусная 4,75 Глицин 9.5
Пропноновая 4,85 Таурин GABA 9.7 11,3
Условные обозначения: MES - морфолиноэтансульфокислота; MOPS - морфолнно-
3-пропансульфокислота; ACES - (М-2-ацетамидо-2-аминоэтан) сульфокислота;
TES - К-трнс(гнд-рокснметнл)метил-2-амннопропансульфонат; трицин - Ы-
трис(гидрокснметнл)ыетнлглнцнн; бнцнн - N,N/-6Hc(2-rHflpoKCH3THfl)
глицин; GABA - 'V-аминомасляная кислота; ADA- N-2-
ацетаминоиминодиуксусная кислота; BES - М,М'-бис(-2-гидроксиэтил)-2-
аминоэтан* сульфокислота; HEPES - М-2-гидроксиэтилпиперазин-К'-2-
этансульфокислота; PIPES - липеразин-№,М'-бис (2-этан) сульфокислота;
бис-трис - бис(2-пидроксиэтиламино-трис-гндро-ксиметил)-метан; трис -
трнс(гидроксиметил)аминометан.
2. Это в свою очередь указывает, что фокусирование сводится к
равновесному распределению (т. е. к ИТФ) компонентов в порядке
возрастания р/С для неамфотерных соединений или в порядке возрастания pi
для амфотерных соединений. То же самое происходит при замене буферов,
используемых при ИТФ в качестве католита и анолита, на основание и
кислоту. При этом образуется "кислотно-основная клетка", которая и не
позволяет разделяемым компонентам выйти за пределы колонки.
Таким образом, можно сделать два практических вывода.
а. Добиться стабилизации градиента pH при ИЭФ (в частности, против
катодного дрейфа) можно, уравнивая pH анолита с pi наиболее кислого
