Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Если диаметр резервуара больше диаметра смесителя (рис. 52, /), то начальные изменения плотности будут резче выражены, чем в случае линейного градиента, зато конец градиента будет более пологим. Это означает, что если в резервуаре находится более плотный раствор сахарозы, то градиент будет выпуклым (а), а если менее плотный — вогнутым (б). Только вариант б пригоден для создания градиента сахарозы с резким нарастанием плотности у дна пробирки. Жидкость, вытекающую из смесителя, в этом случае придется наслаивать по стенке пробирки.
Если диаметр резервуара меньше диаметра смеситель (рис. 52, 2), то начальные изменения плотности относительно невелики и градиент начинается более полого, чем линейный. Это будет компенсировано резким изменением плотности в конце формирования градиента. Теперь ситуация становится обратной. Вогнутый градиент с резким нарастанием плотности в области высоких ее значений образуется в том случае, если в резервуаре находится более плотный раствор сахарозы (в). Вносить его в пробирку можно только на дно, через иглу шприца.
Отклонения от линейности тем значительнее, чем больше разница диаметров резервуара и смесителя. Все рассмотренные случаи описываются общим уравнением для формирования градиента в сообщающихся между собой открытых цилиндрах:
Здесь pv — плотность жидкости, вытекающей после расходования объема V; «р» и «см» — индексы, относящиеся соответствен-
но к резервуару и смесителю; рр и рси — исходные значения плотности; Vp и VCH — исходные объемы; Sp и SCM — площади сечения цилиндров. В частности, при равенстве диаметров цилиндров получается линейная зависимость вида
PV = Рем + (рр — Рем) v — •
^р т* *СМ
Экспоненциальный градиент сахарозы образуется в том случае, если объем жидкости в смесителе остается постоянным (рис. 53). Жидкость из бюретки или делительной воронки (/) поступает в смеситель (2) по мере вытекания из него смеси. Шприц нужен для того, чтобы создать в полости смесителя первоначальное давление воздуха, уравновешивающее гидравлический напор столба жидкости в бюретке. В этом случае при открывании крана бюретки жидкость не начнет поступать в смеситель до начала вытекания из него смеси в пробирку. Этот же шприц используют для заполнения трубочки сифона. Возможны и другие конструкции, в том числе и описанные выше сообщающиеся цилиндры, у которых смеситель закрыт пробкой. При этом можно использовать магнитную мешалку, так как уровень жидкости в смесителе не имеет значения.
Если в смесителе находится более плотный раствор сахарозы, то градиент будет вогнутым (рис. 53, а), а если менее плотный — выпуклым (б). В обоих случаях крутой участок изменения плотности находится в начале формируемого градиента. Вариант а с заполнением пробирки по стенке используют для торможения тяжелых частиц при подходе ко дну пробирки. Вариант б с заполнением через иглу со дна удобен для разделения близких по скорости оседания зон. На крутом участке градиента, вблизи мениска, они сужаются, а на более пологом — лучше расходятся между собой.
Экспоненциальный градиент используют и для создания изо-кинетических условий центрифугирования в более длинных пробирках, чем у ротора SW50.1. Его расчетными параметрами в этом случае являются концентрации растворов сахарозы в смесителе и резервуаре (бюретке), а также объем смесителя. Чем меньше этот объем по сравнению с полным объемом градиента (Vn), тем круче изменяется градиент на начальном участке. Объем жидкости в бюретке роли не играет — он только должен быть больше, чем объем пробирки. При равенстве объемов смесителя и пробирки форма градиента лишь незначительно отличается от линейной. Однако конечная концентрация смеси будет ненамного больше (в отличие от описанного выше линейного градиента), чем средняя величина между концентрациями растворов в смесителе и резервуаре. Заметная крутизна градиента обнаружится при соотношении УСм/Уп =»*/*. При этом конечная концентрация смеси будет близка к концентрации раствора в резер-вуаре (рис. 54).
Рис. 62* Формирование нелинейных градиентов плотности растворов в сообщающихся цилиндрических сосудах разного диаметра (см. текст)
Рис. 53. Устройство для создания экспоненциального градйента плотности раствора (см. текст)
/ — резервуар; 2 — смеситель
Для предварительного расчета формы градиента можно воспользоваться следующим выражением:
__
pv — Рр (Рр — Рем) в > где pv —плотность смеси после вытекания объема V; рр и рсм— соответственно плотности растворов в резервуаре и в смесителе; VcH — объем смесителя.
Рис. 54. Влияние объема смесителя (I— Рис. 55. Заполнение пробирки
5 мл; 2—20 мл) на форму экспоненциального градиента плотности раствора
Наслоение препарата на градиент
При осуществлении этой ответственной операции нужно Добиться того, чтобы препарат лег на градиент ровным тонким слоем, и не допустить его смешения с верхними слоями градиента. Наслаивать препарат удобно из пипетки с насаженным на нее и оттянутым до малого диаметра полиэтиленовым наконечником. Пробирку лучше слегка наклонить (градиент от этого не пострадает). Наконечником пипетки надо коснуться мениска градиента, а затем отвести его по стенке пробирки немного вверх, оставить влажный след, и затем уже по нему медленно спускать препарат, постепенно отодвигая наконечник так, чтобы он оставался чуть выше поверхности слоя препарата (рис. 55). В этой операции целесообразно попрактиковаться, используя окрашенный раствор такой же плотности, как у препарата.
