Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование" -> 106

Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование — М.: Наука, 1981. — 288 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforeziultracentrifiguriya1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 100 101 102 103 104 105 < 106 > 107 108 109 110 111 112 .. 130 >> Следующая

Для s20iW*=10S (2=0,6) аналогичным путем найдем: *//,=• = 0,1. Сравнивая этот результат с предыдущим примером, можно заключить, что при меньшей скорости вращения ротора, использовав более пологий градиент в области несколько меньших концентраций сахарозы и увеличив время центрифугирования до
9 ч, авторы получили примерно такое же распределение частиц по градиенту. Однако если бы они центрифугировали в течение 11 ч, то распределение было бы еще лучше (для 10 S частиц x/L = 0,12, а для 90 S — 0,8).
Здесь уместно отметить достаточно большую свободу выбора условий зонально-скоростного центрифугирования и возможность их широкого варьирования в разумных пределах. Важно лишь обоснованно оценить эти пределы — порядок значений скорости и продолжительности центрифугирования, а главное — выбрать наиболее удобную форму градиента сахарозы. К тому
же, такая оценка освобождает экспериментатора от стремления точно и без критического осмысливания копировать описанные в литературе условия эксперимента, как видно из следующего примера.
ПримерЗ. Полупрепаративное разделение 40S и 60S субъединиц рибосом животного происхождения [Martin et al., 1971]. Условия центрифугирования: ротор SW27 (6x38,5 мл), градиент 10—30% сахарозы, частота вращения 27 ООО об/мин, температура 4°, продолжительность 8 ч.
Проверка, аналогичная описанной выше, показывает, что 60S субъединицы в этом случае не доходили даже до середины пробирки, а расстояние между пиками составляло примерно 0,15 длины градиента. Если задать для 60S субъединиц положение x/L=0,S, то следовало бы центрифугировать 14 ч. При этом расстояние между пиками 40S и 60S увеличилось бы примерно до 0,25 длины градиента, но они расширились бы за счет диффузии. По-видимому, надо признать неудачным выбор градиента. Для относительно близких значений s20|«. субъединиц (их отношение равно 1,5) следовало бы выбрать градиент 5—20% сахарозы, тем более что исходный препарат у авторов растворен в водносолевом буфере без сахарозы. В этом случае после 8 ч центрифугирования при той же скорости пики субъединиц занимали бы на градиенте положения, соответствующие примерно 0,5 и 0,75 его длины.
Пр имер 4. Фракционирование полисом разного размера из печени крысы [Ramsey, Steele, 1976]. Для полисом плавучую плотность можно считать равной 1,4 г/см3. При переходе от моносом ко все более крупным полисомам значение s20,M возрастает от 80S нелинейно: для димеров s20,o>= 123S, для триме-ров—154S. Прирост все время уменьшается, и для декамеров S2«,« = 316S, а не 800S. Причина этого в том, что константа седиментации вообще увеличивается не пропорционально массе частицы sM,„=ftAf0,M). Кроме того, крайние рибосомы в длинной полисоме оседают почти независимо друг от друга. В предельном случае, при отсутствии связи между рибосомами, вся их совокупность характеризовалась бы значением s2o>li, = 80S.
Ясно, что центрифугировать следует недолго, чтобы моносомы оставались в начале пробирки, а в конце ее еще находились к моменту окончания опыта частицы с s20,<o порядка 400S. Для ротора SW27 хорошо бы взять градиент, близкий к изокинетиче-скому, но в области относительно больших плотностей раствора сахарозы, так как отношение крайних значений константы седиментации значительно (400:80=5). Для градиента 15— 30% сахарозы на холоду и максимального числа оборотов ротора (27 000 об/мин) прикинем время центрифугирования, обеспечивающее продвижение 400S частиц на 0,7 длины градиента (чтобы увидеть и «хвост» разделения — крупные полисомы, не разделившиеся на отдельные пики). Из соответствующего графика (см. рис. 59) для x/L =0,7 найдем 2 = 6,5, а из основ-
ной формулы /=2,2 ч. При этом оказывается, что для моносом x/L — 0,13, что вполне удовлетворительно.
В цитируемой работе использовался истинно изокинетиче-ский градиент сахарозы (см. выше) 15—27,8%. В этом градиенте тяжелые полисомы й нижней части пробирки будут оседать несколько быстрее, чем в линейном градиенте 15—30%, так что понятно, почему авторы работы остановились на продолжительности центрифугирования, равной 1,75 ч. Полученный ими
профиль фракционирования свидетельствует о хорошем разделении (рис. 60).
Иногда для разделения полисом используют более крутой градиент сахарозы (15—40% или 0,5—1,5 М, т. е. 16,1—43%). В этих случаях центрифугируют при частоте вращения ротора SW41Ti около 40 тыс. об/мин в течение такого же времени (примерно 2 ч).
Пример 5. Фракционирование суммарной РНК [Panasci et al., 1977]. Если необходимо при одном центрифугировании разделить весь набор РНК от 4S до 28S (1:7), то следует воспользоваться крутым градиентом с интервалом концентраций в 25% (например 10—35%) при максимальной скорости вращения ротора SW40Ti.
Авторы работы именно для такого градиента и этого ротора использовали следующий режим центрифугирования: 30 000 об/мин, 14 ч при 4°. Этот выбор режима представляется неудачным. Оценочные расчеты с помощью номограмм (р = = 1,5 г/см3) показывают, что для 28S РНК jc/L=0,45, а для 4S 0,06.
Лучше всего было бы предварительно отделить 4S и 5S РНК от 18S и 28S РНК методом гель-фильтрации.
Предыдущая << 1 .. 100 101 102 103 104 105 < 106 > 107 108 109 110 111 112 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed