Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Фрагменты эукариотической частично гидролизованной Sau ЗА, ДНК (30-50 kb), обогащенные с помощью фракционированип в сахарозном градиенте
©1 Исходный фильтр хранится с фильтром-репли-©Гкой в виде сэндвича при -70°С
@ Один фильтр-реплика хранится на
чашках с агаром HMF 2 амп при -70°С
@[Два фильтра-реплики используются для гибри-©Гдиэации
BamHI
Методы, применяемые в молекулярной иммунологии
21
на 1,5 см ниже верхнего края пробирки, выключают насос и заменяют остающийся сахарозный раствор в смесителе для градиента 40%-ным раствором сахарозы. Включают насос повторно и продолжают заполнять пробирку до тех пор, пока уровень не будет достигать 0,5 см от края пробирки. В результате этого на дне пробирки образуется подушка 40%-ной сахарозы. Пробирки уравновешивают, удаляя сахарозный раствор из верхней части градиента, и медленно наслаивают ДНК (до 1 мл на пробирку). Градиенты центрифугируют в течение 20 ч при 26 ООО об/мин и 20 °С. Для остановки ротора после центрифугирования нельзя пользоваться тормозной системой центрифуги\
В. Идентификация фракций,
содержащих фрагменты ДНК размером 30—50 kb
После центрифугирования из пробирок с помощью насоса медленно отбирают фракции по 0,7 мл (собирают около 30 фракций с помощью коллектора). По 10 мкл каждой из фракций (№ 1—17) анализируют в 0,3%-ном агарозном геле вместе с маркерными фрагментами ДНК фага К, которые наносят на среднюю и крайние дорожки геля. К маркерным фрагментам добавляют по 10 мкл 40%-ного раствора сахарозы, чтобы концентрация сахарозы и солей в них была такой же, как и в пробах. Длительность электрофореза составляет 16 ч при 40 В.
Фракции, содержащие фрагменты ДНК размером от 30 до 50 kb, объединяют (фракции, содержащие фрагменты ДНК размером <30 kb отбрасывают) и осаждают 2,5 объемами этанола (соль дополнительно не добавляют). Материал перемешивают и оставляют при —25 °С на ночь. На следующий день пробирки нагревают до комнатной температуры (для того чтобы растворить сахарозу, если она выпала в осадок) и собирают ДНК центрифугированием. Если общий объем составляет ~10 мл, то ДНК осаждают в полиалломерной пробирке ротора SW27. Чтобы пробирка не разрушилась при центрифугировании, ее заполняют доверху 70%-ным этанолом. Длительность центрифу-
Рис. 1-1. Конструирование космидной библиотеки с использованием вектора pNNL (Grosveld et al., 1982). Положение сайтов рестрикции в pNNL известно (Grosveld et al., 1982; Steinmetz et al., неопубликованные давиые), однако оии даны ие в масштабе, cos—cos-последовательность в бактериофаге К; amp — ген резистентности к ампициллину из плазмиды pBR322; Eco-gpt — геи ксантин— гуаиин-фосфорибозилтрансферазы Е. coli, полученный из плазмиды pSV2 gpl (Grosveld et al., 1982). Звездочка в интексе относится к дефосфорилированно-му 5'-концу. Другие объяснения даны в тексте.
22 Глава 1
гирования составляет 15 мин при 15 000 об/мин. Осадок ДНК промывают 70%-ным этанолом (в этом случае также пробирку заполняют 70%-ным этанолом доверху), центрифугируя пробу при 15 000 об/мин 15 мин, и подсушивают при комнатной тем-пературе (пробирку ставят вверх дном на бумажное полотенце примерно на 1 ч). Растворяют ДНК в 50 мкл ТЭ-буфера, при-чем для полного растворения пробирки с ДНК оставляют на ночь в холодильнике и встряхивают их время от времени. Концентрацию ДНК определяют, нанося 1, 2 и 3 мкл разведенного в 10 раз раствора в чашку с агарозой, содержащей 1 мкг/мл бромистого этидия. Результаты сравнивают со стандартными пробами, в которые вносили по 1 мкл растворов ДНК фага К в ТЭ-буфере с концентрациями 200, 100, 60, 30, 10, 6 и 3 мкг/мл. Агарозную чашку (не закрывая ее крышкой) кладут вверх дном на УФ-иллюминатор и фотографируют. Ожидаемый выход составляет ~20 мкг ДНК.
Примечание. Для того чтобы избежать лигирования несосед-них фрагментов ДНК в ходе последующей лигазной реакции, фрагменты эукариотической ДНК могут быть дефосфорилиро-ваны (Ish-Horowicz, Burke, 1981). В библиотеках, полученных по данной прописи, клоны, содержащие несоседние фрагменты эукариотической ДНК, обнаруживали с частотой ~1—5%.
Г. Приготовление «плеч» вектора
Представленная ниже пропись относится к космидному вектору pNNL (Brosveld et al., 1982), содержащему ген Eco-gpt, облегчающий перенос клонированных генов в эукариотические клетки. Эту пропись с соответствующими модификациями можно применить и в случае других космидных векторов. Одну аликвоту ДНК вектора pNNL (20 мкг) гидролизуют рестрикта-зой Нра\, а другую такую же — рестриктазой Clal. Добавляют по 20 ед. каждого фермента и инкубируют 4 ч при 37 °С. Реакцию останавливают, помещая пробы в лед, и проверяют полноту гидролиза гель-электрофорезом в мини-геле 0,6%-ной агарозы. Если гидролиз прошел полностью, к каждому из гидролизатов добавляют равный объем фенола, объединяют пробы в одной пробирке и проводят экстракцию. Затем их экстрагируют севагом, добавляют 1/10 объема 3 М ацетата натрия, pH 5,2, и осаждают этанолом. Осадок промывают 70%-ным этанолом и высушивают в концентраторе Speed Vac (Savant).
