Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
ДНК вновь растворяют в 50 мкл 10 мМ трис-НС1, pH 8,0, и удаляют концевые 5'-фосфатные группы с помощью фосфата-зы из кишечника теленка (ФКТ) (Maniatis et al., 1982). В пробу с конечным объемом 100 мкл добавляют 0,75 ед. ФКТ (Boeh-
Методы, применяемые в молекулярной иммунологии
23
ringer) и инкубируют ее при 37 °С 30 мин. Затем добавляют еще
0,75 ед. ФКТ и инкубируют еще 30 мин. Реакцию останавливают добавлением 80 мкл Н20, 20 мкл ЮхТНЭ-буфера (100 мМ трис-НС1, pH 8,0, 1 М NaCl, 10 мМ ЭДТА) и 10 мкл 10%-ного ДСН. Прогревают пробы при 68 °С в течение 15 мин, проводят дважды экстракцию фенолом и дважды севагом. Экстрагируют все фенольные фазы и фазы севага одной порцией ТЭ-буфера объемом 100 мкл, водные фазы объединяют, добавляют Vio объема (20 мкл) 3 М ацетата натрия, pH 5,2, и осаждают этанолом. Осадок промывают 70%-ным этанолом, высушивают (Speed Vac) и растворяют в 150 мкл ТЭ-буфера. Отбирают
0,25 мкг ДНК (1 мкл) и проверяют полноту дефосфорилирова-ния в реакции лигирования фрагментов. Добавляют 7 мкл Н20, 1 мкл 10-кратного буфера для лигирования, 1 мкл ДНК-лигазы фага Т4. Смесь инкубируют 1 ч при 15 °С и анализируют в 0,6%-ном мини-геле вместе с 1 мкл нелигированных векторных фрагментов (контрольной смесью, например, фрагментами Pstl из плазмиды pBR322) и маркерными фрагментами ДНК фага К.
Если дефосфорилирование прошло полностью, то векторные фрагменты гидролизуют рестриктазой ВатШ (160 ед.) 1 ч при 37 °С. Реакцию останавливают, перенося пробирку в лед, и полноту гидролиза (0,25 мкг) проверяют в 0,6%-ном агарозном мини-геле. Затем пробу один раз экстрагируют фенолом и один раз севагом. ДНК осаждают из водной фазы этанолом, промывают 70%-ным этанолом, высушивают в концентраторе Speed Vac и осадок растворяют в 50 мкл ТЭ-буфера (ДНК 800 мкг/мл). Убедитесь, что фрагменты ДНК можно лигировать.
Д. Лигирование фрагментов вектора
и эукариотической ДНК
В состав реакционной смеси для лигирования в объеме
10 мкл входят: 1,5 мкг (4 мкл) ДНК после фракционирования по размерам, 1,5 мкг векторных фрагментов pNNL (2 мкл; 6-кратный молярный избыток) и Н20 до конечного объема 8 мкл. Смесь инкубируют при температуре 70 °С 8 мин, после чего переносят на 30 мин в ледяную баню. Добавляют 1 мкл 10-кратного буфера для лигирования и 1 мкл ДНК-лигазы фага Т4. Перемешивают на вортексе, центрифугируют в течение короткого времени и инкубируют при 15 °С 2 ч. Результаты лигирования проверяют в 0,6%-ном агарозном мини-геле, нанося образец вместе с нелигированной векторной ДНК и маркерными фрагментами ДНК фага X.
24 Глава 1
Е. Упаковка in vitro
Для упаковки in vitro экстрактам (Amersham или любая другая фирма) дают возможность оттаять 6 мин во льду, после чего выполняют все операции по инструкции изготовителя. Используют от 1 до 3 мкл лигированной ДНК (от 0,3 до 0,9 мкг суммарной ДНК, содержащей 0,15—0,45 мкг эукариотической ДНК, фракционированной по размерам) на одну упаковку. Ожидаемый выход составляет от 2-105 до 2-10® колоний на
1 мкг эукариотической ДНК, фракционированной по размерам.
Ж. Титрование
Для высева готовят клетки Escherichia coli 490А (Steinmetz et al., 1982a) по Маниатису и др. (Maniatis et al., 1982). С помощью буфера для разведения фага готовят следующие разбавления упакованных космид в стерильных пластиковых пробирках на 5 мл (Falcon № 2036). Сначала упакованные косми-ды (1 мкл) разводят в 99 мкл буфера. (А) 1 мкл этого разведения добавляют к 49 мкл буфера. (?) 10 мкл исходного разведения добавляют к 40 мкл буфера. (В) 1 мкл упакованных космид добавляют к 49 мкл буфера. (Г) 10 мкл упакованных космид добавляют к 40 мкл буфера. Во избежание денатурации упакованных космид при этих разведениях материал перемешивают не на вортексе, а с помощью пипетки, медленно набирая и выпуская из нее содержимое. В пробирки от А до Г добавляют 100 мкл суспензии Е. coli 490А, перемешивают и инкубируют при 37 °С 20 мин. После этого добавляют 1 мл L-бульо-на, перемешивают и инкубируют еще 60 мин при 37 °С (чтобы могли экспрессироваться гены резистентности к ампициллину). По 200 мкл клеток из каждой пробирки выливают в чашки L-амп и распределяют их по поверхности стерильной пастеровской пипеткой с загнутым кончиком. Эффективность упаковки рассчитывают по уравнению
Число колоний в чашке Г-1,15 мл-53 ч
0,2 мл-мкг ДНК, использованной для упаковки ‘
Допустим, например, что в чашке А выросла 1 колония, в чашке ? — 2 колонии, в чашке В—64 колонии и в чашке Г — 602 колонии, а для упаковки было использовано 0,15 мкг эукариотической ДНК, фракционированной по размерам. Это дает эффективность упаковки, равную
602.1,15-53 0 1ПЯ
0,2-0,15 M-1U.
колоний на 1 мкг эукариотической ДНК, фракционированной по размерам.
Методы, применяемые в молекулярной иммунологии
25
3. Рассев библиотеки
Для получения библиотеки объемом 600 000—900 000 кос-мидных клонов упаковывают достаточное количество ДНК-В космидной библиотеке такого размера вероятность присутствия любой данной последовательности превышает 99,9%. Требуемое количество упакованных космид смешивают с двумя объемами суспензии клеток Е. coli 490А в эрленмейеровской колбе на 250 мл и инкубируют 20 мин при 37°С. Добавляют 20 объемов (по отношению к упакованным космидам) L-бульо-на и инкубируют еще в течение 60 мин при 37 °С. Клетки переносят в пластиковую пробирку на 50 мл (Falcon № 2070) и центрифугируют на мини-фуге (Heraeus) при 3000 об/мин
