Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
10 мин. Надосадочную жидкость сливают и клетки ресуспенди-руют в 12 мл L-бульона пипетированием. Отбирают 5 мкл на титрование, смешивают этот материал с 200 мкл L-бульона и вносят в чашку со средой L-амп.
Аликвоты по 1,2 мл клеточной суспензии наносят прямо на нейлоновые фильтры [«gene screen plus» (NEN), нарезанные на квадраты 22X22 см с закругленными краями] в больших чашках с L-амп [23X23 см (Nunc)]. Предварительно по крайней мере за 7 дней до эксперимента чашки заливают L-агаром и хранят при комнатной температуре. Непосредственно перед высевом клеток чашки ставят в термостат при 37 °С примерно на 1 ч. Фильтры нужного размера используют в том виде, в каком они поставляются изготовителем. Их не автоклавируют, и прикасаются к ним только через защитную бумагу. Поставляемые фильтры стерильны и лучше сохраняют стерильность при хранении под ультрафиолетом. Клетки размазывают по фильтру с помощью большой стерильной пастеровской пипетки с загнутым кончиком, оставляя вдоль его краев незасеянную зону шириной 0,5—1,0 см. Это делают быстро, распределяя клетки равномерно, но не до сухого состояния. Чашки оставляют при комнатной температуре до тех пор, пока вся жидкость не всосется. После этого их инкубируют вверх дном при 37 °С в течение
11 ч, но не более. Эксперимент планируется таким образом, чтобы эта инкубация происходила в ночное время.
И. Получение реплик
На следующее утро (диаметр колоний должен быть менее
0,5 мм) чашки вынимают из термостата и фильтры метят с помощью черного маркера Edding 3000 номерами от 1 до 10. 20 фильтров помещают в чашки с агаром L-амп и 20 таких
26 Глава 1
же фильтров — в чашки со средой HMF-1 амп. Эти фильтры также метят номерами от 1 до 10.
Для получения реплик (Hanahan, Meselson, 1983) основной фильтр вынимают из чашки, захватив его пинцетом (Millipore) с плоскими браншами за два угла, находящиеся по диагонали друг от друга, и кладут на стерильный лист бумаги (Whatman) 3 ММ (колониями вверх). Фильтр из набора для получения реплик кладут на исходный фильтр таким образом, чтобы сторона, которая будет находиться в контакте с агаром, была обращена вверх. Это делают очень осторожно, удерживая накладываемый фильтр за два угла пинцетом (Millipore). После того как фильтр для получения реплики пришел в контакт с исходным фильтром, их нельзя сдвигать относительно друг друга. Полученный сэндвич накрывают стерильной бумагой Whatman 3 ММ и сдавливают большой пластмассовой коробкой с плоским дном. Верхнюю бумагу Whatman 3 ММ выбрасывают и иглой для шприца № 20 GIV2, содержащей тушь, маркируют фильтры, делая в них 10 отверстий: 3 внизу, 3 в середине, 3 вверху и одно в левом верхнем углу. Фильтры осторожно отделяют друг от друга и опять помещают в чашки с агаром L-амп (колониями вверх). Фильтр, использованный для получения реплики, кладут в свою чашку, в то время как исходный фильтр помещают в чашку со свежим агаром L-амп.
Исходный фильтр инкубируют 1—2 ч при 37 °С, после чего аналогичным образом получают вторую реплику. Маркирование отверстия исходного фильтра переносят на вторую реплику с помощью иглы. После получения второй реплики исходный фильтр помещают в чашку со средой HMF-1 амп. С каждого исходного фильтра необходимо получить по три реплики. Третий набор фильтров с репликами инкубируют в чашках со средой HMF-1 амп. Наконец, четвертый фильтр с репликой (используют фильтры, смоченные в чашках со средой HMF-1 амп) готовят для каждого из исходных фильтров. Два последние фильтра, однако, не отделяют друг от друга, а замораживают в виде сэндвича (Hanahan, Meselson, 1983). Сэндвич, обернутый листами бумаги Whatman 3 ММ, смоченными водой, кладут в полиэтиленовый мешочек, который заплавляют и замораживают при —70 °С.
Три фильтра-реплики, полученные от каждого исходного фильтра (два набора на агаре L-амп, один на агаре HMF-1 амп), подращивают при 37°С до тех пор, пока диаметр колоний не станет равным ~ 1 мм. Первые два набора используют для скрининга библиотеки с помощью гибридизации (см. ниже), в то время как третий набор, инкубированный в чашках с агаром HMF-1 амп, переносят в чашки с агаром HMF-2 амп и оставляют на 2 ч при комнатной температуре. Чашки кладут
Методы, применяемые в молекулярной иммунологии
27
в герметично закрывающиеся полиэтиленовые мешочки и замораживают при —70 °С. Этот набор используют для отсева положительных колоний, выявляемых с помощью радиоактивных зондов.
К. Лизис и связывание с ДНК
На дно 12 квадратных пластмассовых чашек (можно использовать крышки от чашек Nunc размером 23X23 см) кладут один слой бумаги Whatman 3 ММ (23X23 см). Смачивают бумагу: 10%-ным ДСН (четыре чашки); 0,5 М NaOH, 1,5 М NaCl (четыре чашки); 0,5 М трис-НС1, pH 8,0, 1,5 М NaCl (четыре чашки) (Grosveld et al., 1981; Maniatis et al., 1982). Для выравнивания слоев бумаги и удаления пузырьков воздуха используют загнутую стеклянную палочку. Избыток жидкости сливают. Три пластмассовых подноса, содержащих: 750 мл 0,5 М трис-НС1, pH 8,0, 1,5 М NaCl; 750 мл 2XSSC, 0,1%-ного ДСН; и 750 мл 2XSSC, ставят на платформы для покачивания. На стопку из пяти слоев бумаги Whatman 3 ММ кладут чистую стеклянную пластинку размером 30x30 см, наливают в стакан
