Молекулярная биология, избранные разделы - Ашмарин И.П.
Скачать (прямая ссылка):
Необходимо, наконец, остановиться на таксономических границах распространения гистонов среди живых существ. Типичные гистоны, подробно охарактеризованные выше, характерны для многоклеточных. Гистоны есть и у одноклеточных эукариотов (протозоа, грибы, хлорелла и т. п.), однако там часто отмечают иные соотношения между главными фракциями и ДНК, а также отсутствие отдельных фракций. У организмов, являющихся переходными между эу- и прокариотами — динофлагеллят — отношение гистоны : ДНК в десять раз ниже, чем у многоклеточных, и преобладает фракция, подобная /2а1 (Rizzo, Nooden, 1972). У бактерий гистоны не обнаруживаются. Однако у вирусов отмечено существование так называемых .внутренних катионных белков, связанных с ДНК и РНК. Таким образом, появление гистонов связано, по-видимому, с двумя процессами: 1) усложнением «архитектуры» хроматина и 2) появлением новых регуляторных механизмов, особенно характерных для многоклеточных.
НЕГИСТОНОВЫЕ БЕЛКИ ХРОМАТИНА
Негистоновые белки представляются сейчас наиболее интригующими компонентами хроматина. Это определяется чрезвычайными трудностями их выделения и очистки и особенно уже упоми-
навшейся выше склонностью хроматина при выделении довольно прочно сорбировать и удерживать некоторые белки ядерного сока, а также опасностью возникновения части негистоновых белков за счет неглубокой деградации сопутствующими протеазами. В отличие от гистонов они более разнообразны по составу, свойствам и функциям.
Часто термин «негистоновые белки» заменяют термином, «кислые белки». Последний является не совсем точным, так как в их числе есть, видимо, определенная доля белков, которые правильнее было бы называть нейтральными или даже слабоосновными. Тем не менее, этот термин применяется широко и более удобен для условных обозначений. В отличие от сокращения для негистоновых белков — НГ (НГБ), ассоциирующегося с нуклеогистонами, обозначение кислых белков — КБ или К — не связано с недоразу-мениями. В то же время надо предостеречь от смешения терминов «негистоновые белки» и «остаточные белки», так как последние являются лишь частью первых.
На схеме 14 иллюстрированы соотношения между разными методами выделения негистоновых белков и типы связей этих белков с ДНК.
Схема 14. Примерная классификация белков хроматина по характеру связей с ДНК и по характерным методам отделения от ДНК
* — электростатическое взаимодействие; ** — водородные связи; ГФ — гидрофобные взаимодействия; КВ — негистоновые белки;. отнесение белков группы 1а к хроматиновым пока является дискутабельным — см, текст.
Один из наиболее эффективных способов отделения всех негистоновых белков от ДНК и гистонов состоит в обработке хроматина 37%, гуанидинхлоридом и присутствии 0,1% дитиотрейтола при pH 7,7—9,1, что обеспечивает, как полагают, расщепление практически всех нековалентных связей между молекулярными
/¦
ДНК
Гистоны _
Негистон. белки 16
»¦
негистон
I I > Негдетои.
ОДУ II
дн
Отлепляются 0,1-0,25 н HCI
ИЛИ H2SO4
Негистон. белки 1а
Отщепляются 0,35—IМ NaCJ (АР 60% всех К Б)
J
Отепляются 0,5<? доде-цилсульфатом
BlMNaCI (до 10 % есйх КБ)
1 Оттеняются 2-2,$ М NaCi с мочевиной ^**$0% всех КБ) Отщепляются 37 % гу а н ид и и х
компонентами. Затем ДНК и РНК удаляются гельфильтрацией, а гистоны — электрофорезом^ Негистоновые белки могут быть далее разделены электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии мочевины или додеци л сульфата натрия примерно на 30 (I) фракций (рис. 40, Hill et al., 1971). Молекулярные веса фракций варьируют от 16 до 175 тысяч. Менее радикальный метод состоит в диссоциации хроматина 2—2,5 М NaCl (в присутствии
5 М мочевины), удалении ДНК ультрацентрифугированием или гельфильтрацией и разделении с гистонами хроматографически или (и) гельфильтрацией. При этом освобождается из ДНК около 90%, или несколько более негистоновых белков (Г. Г. Кривцов и А. А. Богданов, 1970). Не следует, однако, пренебрегать тем небольшим количеством' белка, которое после такого разделения остается связанным с ДНК. Этот так называемый остаточный белок (ОБ) может быть отделен почти полностью при обработке 0,5% додецилсульфатом в присутствии 1 М NaCl (С. Р. Уманский и сотр., 1971). После этого на ДНК остается 0,1—0,2% полипептидов, связанных, по-видимому, ковалентно, отделяемых под действием 1 М NaOH и характеризующихся особенно высоким содержанием серина и валина.
Следовательно, судя по характеру указанных методов, негистоновые белки можно разделить на большую группу связанных с ДНК электростатически и водородными связями — I группа — и небольшую долю связываемых главным образом за счет гидрофобных взаимодействий — II группа (см. рис. 39). В свою очередь в I группу входит подгруппа белков (1а), прочность связей которых в хроматине является наименьшей. Они и расцениваются рядом исследователей как белки, не являющиеся компонентами хроматина in vivo и лишь сорбирующиеся из ядерного сока при его выделении. Wang (1967) смог отделить их воздействием 1М NaCl. При этом гистоны удалялись из смеси продуктов диссоциации хроматина вместе с частью более прочно связанных КБ при последующем снижении ионной силы до физиологических значений. В результате образуется осадок нуклеогистона, а в растворе остается около 60% негистоновых белков. Однако Goodwin и Johns
