Молекулярная биология, избранные разделы - Ашмарин И.П.
Скачать (прямая ссылка):
1972).
Подавление гистонами матричной активности ДНК также приближает искусственные нуклеогистоны к ДНП хроматина. Все фракции гистонов способны подавлять транскрипцию и, в меньшей степени, редупликацию ДНК, блокируя матрицу, создавая пре* пятствия на пути движения полимеразы и ограничивая число возможных мест присоединения энзима к матрице. Вместе с тем, показана способность гистонов воздействовать и непосредственно на РНК-полимеразу (Spelsberg et al., 1969). Наибольшее подавление транскрипции достигается при соотношениях гистон: ДНК, близких к физиологическим. Однако и по этому признаку нуклеогистоны очень грубо моделируют хроматин, так как не воспроизводят специфического подавления строго определенных областей
ДНК, характерных для ткани, которая явилась источником ДНК я гистона. Об этом убедительно свидетельствуют эксперименты по конкурентной гибридизации с ДНК препаратов РНК, синтезированных на исходном хроматине и на искусственном нуклеогистоне. Они практически не конкурируют друг с другом за ДНК, что доказывает различия в нуклеотидных последовательностях, открытых для транскрипции в нативной и модельной матрице.
Многообещающими являются эксперименты по получению модельных ДНП, в которые входят не только гистоны, но и негистоновые белки, так как именно последние рассматриваются сейчас как агенты, способные «узнавать» либо определенные нуклеотидные последовательности, либо участки ДНК сложной конфигурации (опять-таки предопределяемые особенностями первичной структуры ДНК,— см. разделы «ДНК хроматина» и «Негистоновые белки»). Правда, в этом случае используются пока только суммарные препараты негистоновых белков. Первые результаты этих работ подтверждают предположения об их специфической роли. Gilmour и Paul (1969) показали, что комплекс, полученный из ДНК, гистонов и негистоновых белков тимуса теленка, неотличим от нативного хроматина по тесту конкурентной гибридизации синтезируемой на нем РНК.
Роль негистоновых белков весьма рельефно демонстрируется также экспериментами по перекрестной реконструкции хроматина разных видов млекопитающих и данными о тканевой иммуноспецифичности кислых белков (Spelsberg et al., 1971а, б; Chytil, Spelsberg, 1971). Освобожденный от гистонов хроматин печени крысы сводили с очищенными гистонами тимуса теленка и, наоборот, дегистонизированный хроматин тимуса теленка — с гистонами из печени крыс. Далее оценивали способность РНК, синтезируемых на реконструированных хроматинах, конкурировать с РНК, образующейся на нативном хроматине. Конкуренция, свидетельствующая об идентичности транскрибируемых участков, отмечалась для нативного хроматина и комплекса дегистонизирован-ного хроматина того же вида с «чужими» гистонами. Таким образом, гистоны обеспечивают лишь определенную глубину репрессии хроматина, но не специфичность репрессии определенных локусов, которая обусловлена, видимо, негистоновыми белками.
Смысл второго типа экспериментов по реконструкции хроматина— из полных смесей продуктов его диссоциации:—требует некоторых пояснений. На первый взгляд, успешность такой реконструкции может лишь убедить в том, что избранный способ диссоциации не повреждает компонентов хроматина.4 Однако именно такие эксперименты позволяют решить принципиальной важности вопрос о механизме, определяющем специфическое распределение белков вдоль ДНК. В самом деле, если все белки (простые или комплексные) сами по себе обладают способностью узнавать «свои» участки на ДНК, то при соответствующих условиях возможна полная реконструкция. Можно представить себе и другую крайнюю ситуацию, когда связывание с определенным локусом
ДНК обусловлено не специфическим сродством белка к данной нуклеотидной последовательности, а действием при синтезе хроматина каких-то дополнительных факторов, отсутствующих в интерфазном хроматине. Одним из таких факторов может быть, например, определенная последовательность репликации хроматина и присоединения вновь синтезированных белков хроматина. В этом случае попытки реассоциировать хроматин in vitro из полной смеси компонентов приведут к более или менее беспорядочному распределению белков вдоль ДНК и полученный продукт, вероятно, не будет идентичен исходному.
К настоящему времени уже накоплен довольно обширный опыт, свидетельствующий о возможности реконструкции хроматина, неотличимого по ряду тестов от исходного, из продуктов его диссоциации в 2MNaCl с 5М мочевиной. (Bekhor et al., 1969; Huang, Huang, 1969; Spelsberg et al., 1971; И. П. Ашмарин и И. А. Федорова, 1973, и др.). Условием успешной реассоциации является постепенное снижение ионной силы до физиологических значений, например ступенчатым диализом. Важным условием является также присутствие не только NaCl, влияющего на электростатические связи, но и мочевины, влияющей на взаимодействия другого типа. Ее исключение ведет к тому, что реконструированный хроматин приобретает отличия от исходного по тесту конкурентной гибридизации синтезируемой на нем РНК и по тонким физикохимическим характеристикам (например, утрата ступенчатости кривой плавления). По данным Bonner и сотр., особую роль в реконструкции играет описанная выше вРНК, которая «ведет» белки к определенным участкам ДНК. Ее повреждение рибонуклеазой или нитратом цинка нарушает полную реконструкцию. Однако, оценивая эти последние заключения, надо иметь в виду упоминавшиеся выше сомнения в существовании вРНК. Специфичность посадки белков хроматина на ДНК можно объяснить, и не прибегая к гипотезе о вРНК. Уже приводились данные о том, что наибольшей специфичностью обладают различные негистоновые белки. Они либо занимают определенные участки ДНК и предопределяют последующее размещение гистонов, либо, образуя с гисто-нами комплексы, ведут их к тем или иным локусам, подобно гипотетической вРНК- С этим сочетается также некоторая, хотя и весьма ограниченная, тенденция отдельных фракций гистонов к связыванию с зонами, где преобладают ГЦ- или АТ-пары.
