Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Как показано на рис.120, переход от AcPheGlyNH2 к AcPheAlaNH2, т.е. введение одной метальной группы, приводит к значительному снижению уровня энергии переходного состояния практически без- изменения уровня энергии основного состояния. Иными словами, специфичность в этом случае проявляется в максимальной скорости гидролиза, а не в связывании. Такая ситуация харак-
Рис.120. Изменение сво- 12 бодной энергии по координате реакции (г) при §
ацилировании химотрип- |
сина субстратами типа -v.
AcPhe(NO )-X [3344] § д
*
X: 1- OEt; 2- ОМе;
3- NHC,H .N0 -п; ч>
6 4 2 ^
4- NHC6H5; 5- NH2; б- NHNH2; 7- GlyNH2;
В- AlaNH2
О
-«
терна для многих протеаз: особенно четко она проявляется для пепсина (см. разд.4.3.1.3.). Вторичные взаимодействия, по-видимому, играют решающую роль в образовании продуктивного комплекса, причем энергия этих взаимодействий используется для компенсации энергетически неблагоприятных изменений системы (конформационные изменения, дестабилизация р^щепляемой группы и т.д.). Такая трактовка позволяет приблизиться к пониманию причин уникальной специфичности некоторых амидгидролаз. Среди представителей каждой группы ферментов имеются амидгидролазы с широкой специфичностью и такие, которые катализируют гидролиз одного или очень ограниченного числа однотипных субстратов. В качестве примера можно привести почечный ренин, действующий на ангиотен-зиноген и слабо гидролизующий некоторые аналоги N-концевого фрагмента этого субстрата. Не удалось обнаружить каких-либо других пептидов, эффективно гидролизуемых этим ферментом.
Даже в ряду менее специфичных амидгидролаз наблюдаются очень большие различия в скорости расщепления пептидов в зависимости от числа аминокислотных остатков в них (табл. 79). Обращает на себя внимание тот факт, что различия в активности обусловлены изменением &cat, а не К^, т.е. разные ферменты обладают практически одинаковым сродством к данному субстрату, но превращают его со скоростями, отличающимися на 4 порядка.
Таблица 'i9. Гидролиз пептида ZLeuValPhe (NO )AlaApm аспартатными протеазами [1715]
Фермент ft +, о-1 К .ю3, м М-1с-1 Относительная
cat ш активность
Пепсин 43 0,3 1 ,43-10-5 1 ,3-Ю4
Химозин 1 ,16-10-2 0,25 46,4 4,2
Катепсин В 6,6.10“3 0,6 11 1
У этих ферментов вторичные взаимодействия субстрата, по-видимому, в разной степени "индуцируют" изменения, приводящие к продуктивному комплексу. Можно ожидать, что конформационные изменения, индуцируемые при связывании одного и того же субстрата (или субстратоподобного ингибитора), будут менее выражены у более специфических ферментов. Однако сравнительные исследования такого рода не проводились.
Амидгидролазы рассмотренных типов отличаются еще одной важной характеристикой: pH-оптимумом каталитической активности (см. разд.Б.2.3). Эти различия хорошо согласуются с различиями каталитического аппарата этих ферментов. Наличие у сериновых, цистеиновых и металлоэндопепттдаз каталитически активного остатка гистидина, функционирующего как общее основание и общая кислота, ограничивает интервал pH состоящем ионизации имидазольной грушш этого остатка. Характерно, что у цистеиновых ферментов, функционирующих при pH 5-6, значение рКа имидазольной группы в ецилферменте снижено до 4-4,5. В свободном ферменте рКа увеличивается до в, что обеспечивает существование стабильной ионной пары ImH4—S~ (см. разд.7.1).
Очевидно, что в кйслой области pH эффективно функционировать в качестве нуклеофила могут только карбоксилат-ионы. Действительно, протеичазы, рабо-
тающие в кислых средах, относятся к груше аспартатных протеиназ. Повышение pH, приводящее к ионизации обеих карбоксильных групп активного центра, лишает эти группы протондонорных свойств, необходимых для общего кислотного катапиза.
Имеется по крайней мере один пример, когда сериновые протеазы функционируют в слабокислой среде: это сериновые карбоксипептидазы. В настоящее время очень мало известно о строении каталитического аппарата этих ферментов. Не исключено, что в качестве общей кислотно-основной группы у них функционирует карбоксильная трудна, а не имидазольная, как у истинных сериновых амидгидролаз.
Отмечалась тенденция [24611 некоторых амидгидролаз выравнивать энергетические барьеры многостадийных реакций гидролиза, что, возможно, связано с компенсирующими изменениями конформации фермента по ходу катализа. Можно полагать, что это общее свойство феиментов рассматриваемой группы.
В отношении механизма действия амидгидролаз имеется больше нерешенных вопросов, чем установленных фактов. Данные, суммированные выше, относятся лишь к простейшие представителям каждой группы этих ферментов, но и здесь нельзя считать, что мы исчерлали возможности познания.
