Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Glu 72Л„ О 2,0
1—L п х ^ .Zn Н -0\
„¦ ftQ/: чН--0/ / \ / ^С-
0=С—NHR2 0 0 г/
1- X 2
R1 NHR2
\ °\
0)С— .Zn Н-0.
О 'он 0 ------ о о Qc~
лс/ \с/ о
I, NH2R2 /i \+ 2
R 2 R NH?R
Рис.119. Схема механизма катализа карбоксипептидазой А
цистеиновые амидгидролазы, и функционирующие по типу общего катализа - ас-партатные и металлзависише ферменты.
Несмотря на это различие в механизме катализа и строении каталитического аппарата всех до сих пор изученных амидгидролаз имеется много общего. В общем виде схема механизма гидролиза амидов и типы каталитических групп, свойственных представителям различных амидгидролаз, могут быть представлены следующим образом:
R R R
| | 1 |
В: Н-Х С-0 Н А-ВН X С 0~...Н А -¦ В: | |
Ан Ан Х-С-0-... Н-А-*
I I Ан+
i I
R
¦ |
-» В: X С-0 Н-А---^ Повторение цикла (сериновые, цистеиновые).
В R X АН
Сериновые ^N: (His57) -СН2 (Sen 95) 0 NH(Gly193, Seri 95)
Цистеиновые )N:(His159) -CH2(Cys25) S NH(Gln19, С-ув25)
0
II
Аспартатные ---C-0~(Asp32 И H 0 Н (?)
Asp215)
0
Металлзависимые -С-0 (Glu270) Н 0 Zn2+.
Сходство мевду этими механизмами достаточно очевидно.
Попытаемся проанализировать важнейшие каталитические свойства амидгидролаз с точки зрения изложенных выше механизмов катализа. Наличие системы расположенных рядом нуклеофильных и электрофильных группировок обеспечивает возможность расщепления электронно-лабильных связей производных карбоновых кислот. Реакция гидролиза амидной связи - это ступенчатое понижение энергии С-N связи за счет поляризации:
О О О- О- о
_,JL*NH_*. —C-NH-----------»—i-NH-> —с—nh2-----------------> —с
I
.А 1.37 1.39 1-43 1.50
I I
х X
rC-N
ДЕС_М 86 -70 66 46 о
ккал/моль
Для осуществления такого процесса в физиологических условиях достаточно того набора нуклеофильных и электрофильных групп, который имеется в белках, в том числе амидгидролазах. Очевидно, что эти группы недостаточно активны для того, чтобы присоединяться к насыщенному атому углерода. Катализ реакций переноса насыщенных групп осуществляется в ферментах при посредстве кофакторов, таких, как, например, S-аденозилметионин (см. в: [14051).
Вместе с тем в ряду производных карбоновых кислот специфичность (в терминах &cat/xm) ферментов разных типов по отношению к разным связям варьирует (см. разд.4.3.1.1).
Было показано [2009,3344], что различия в скоростях гидролиза эфиров и амидов у сериновых протеаз, достигающие четырех порядков, обусловлены исключительно различиями в стандартной свободной энергии их гидролиза, т.е.
объясняются различным состоянием расщепляемой связи в субстрате (рис.120). Энергетический уровень переходного состояния для эфиров и амидов практически одинаков. Это является демонстрацией справедлиьости в данном случае постулата Хэммонда [15313 о сходстве структуры основного и переходного состояний в экзоэргических реакциях и указывают на определяющую роль основного состояния фермент-субстратного комплекса в реакциях, катализируемых серино-выми протеазами.
У аспартатных и металлзависимых протеаз соотношение скоростей гидролиза эфир-амид близко к единице. Это трактовалось [3342] как свидетельство превалирующей роли электрофильного катализа (т.е. протонирования карбонильного углерода и координации с металлом) у этих типов ферментов. Следует отметить, что и у цистеиновых протеаз соотношение иефИр/1,амИдк,Б. Вклад электрофильного катализа в этом случае невелик. Возможно, что, по крайней мере в случаях аспартатных и цистеиновых протеаз, отсутствие заметных различий в скоростях гидролиза эфиров и амидов объясняется, если не полностью, то частично, меньшей разницей в свободных энергиях гидролиза этих субстратов при более кислых значениях pH (см. рис.28). Следует отметить, что существуют амидгидролазы, функционирующие в нейтральной среде и совсем не имеющие эс-теразной активности. Различие в поведении эфирных и амидных субстратов карбоксипептидазы А может быть обусловлено различиями в характере определяющей скорость стадии многостадийного процесса гидролиза [3139].
