Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Глава 5 ЗОНАЛЬНО-СКОРОСТНОЕ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
Особенности этого типа центрифугирования отражены в его названии: «скоростное», потому что частицы разделяются по скорости оседания, причем плотность их значительно больше, чем плотность среды, и «зональное», так как частицы разных размеров оседают более или .менее ограниченными слоями — зонами. Осадков не образуется. После того как зоны достигнут оптимального распределения вдоль радиуса вращения, центрифугирование прекращают, и зоны частиц извлекают одну за Другой. Таким образом, в отличие от предыдущего случая, частицы разных размеров очищаются не раздельно, а одновременно, при одном центрифугировании.
Исходную смесь частиц разных размеров наносят .в виде тонкого слоя на более плотную среду, заполняющую весь объем пробирки бакет-ротора или полости зонального ротора (для зонально-скоростного центрифугирования используют только эти Два типа роторов). В ходе центрифугирования наиболее тяжелые частицы быстро продвигаются ко дну пробирки или к пе-
риферической области зонального ротора, в определенной степени (что обусловлено диффузией) сохраняя очертания исходного слоя. За ними с отставанием, но тоже в виде отдельного слоя, двигаются менее крупные частицы, затем еще более мелкие и т. д. Так образуются дискретные зоны, или полосы частиц, отличающихся друг от друга скоростью оседания.
Для того чтобы зоны были узкими, необходимо противодействовать конвекции жидкости, в которой движутся частицы. Эффективный способ подавления конвекции — увеличение плотности этой жидкости вдоль радиуса вращения в направлении от центра к периферии. Для этого создают так называемый «градиент плотности среды». Например, можно заполнить пробирку бакет-ротора водным раствором сахарозы, концентрация которого нарастает в направлении от мениска жидкости ко дну пробирки, а затем уже на этот «градиент сахарозы» (как его для краткости называют) наслаивать препарат — смесь подлежащих разделению частиц.
Хотя главное назначение градиента плотности среды — препятствовать конвекции, он может играть еще одну немаловажную роль в процессе фракционирования частиц. Вспомним уравнение скорости оседания частиц (см. главу 1):
D* (р — рс) N*r
X) — л ¦ ¦ ¦¦ .
Лс
Из уравнения видно, что скорость движения частиц и, следовательно, соответствующих зон при постоянстве всех прочих параметров должна увеличиваться по мере продвижения вдоль радиуса вращения, т. е. вдоль оси пробирки бакет-ротора. Может случиться так, что зона наиболее тяжелых частиц достигнет дна пробирки раньше, чем две зоны наиболее легких частиц успеют заметно отойти от мениска и разделиться между собой. Нарастанию скорости осаждения частиц можно помешать, если предусмотреть увеличение плотности и вязкости среды (рс и г|с) вдоль радиуса вращения (длины пробирки). Но это как раз и имеет место при наличии градиента плотности. Более того» если плотность и вязкость среды увеличиваются значительно (при «крутом» градиенте), то влияние факторов рс и г\с окажется сильнее, чем влияние увеличения г, и по мере приближения к дну пробирки движение зон будет замедляться.
Таким образом, экспериментатор имеет возможность управлять изменением скорости оседания частиц вдоль пробирки в интересах полного (и быстрого) разделения всех интересующих его зон. Эта возможность обусловлена свободным выбором характера градиента плотности среды.
Зонально-скоростное центрифугирование используют не только для разделения (фракционирования) частиц, но и для определения их характеристик — размеров и плотности. С этой целью удобно ввести величину, зависящую только от этих двух параметров частицы и поддающуюся количественному определению методом ультрацентрифугирования. В интересах сопоставления различных экспериментальных данных эта величина должна иметь универсальный характер, т. е. не зависеть от условий ее определения. Такой величиной служит константа седиментации частицы.
При выводе конечного управления в главе 1 отмечалось, что скорость оседания частицы при центрифугировании (и) пропорциональна величине со2г (со — угловая скорость вращения ротора). Скорость оседания частицы, радиус (расстояние от оси вращения до ее местоположения) и угловая скорость ротора не характеризуют непосредственно частицу (как диаметр и плотность) или среду. Отношение этих параметров называют коэффициентом седиментации: s=o/co2r.
Воспользовавшись выражением для у, содержащим со2г (см. главу 1), легко найти, что fl2(p~pj.
Лс
В случае сферической частицы k' — Отсюда видно, что значение коэффициента седиментации не зависит от скорости вращения и типа ротора, а только от размера и плотности частицы, а также от плотности и вязкости среды центрифугирования. Последнее обстоятельство, очевидно, неприемлемое для универсальной величины, характеризующей только саму частицу, можно обойти, если проводить центрифугирование всегда в одной и той же, «стандартной» и хорошо воспроизводимой среде. В качестве такой среды условились взять воду при температуре 20° С. Плотность и вязкость воды при 20° (p2o,w и r]2o,w) хорошо известны. Коэффициент седиментации частицы, определенный центрифугированием в стандартной среде (s20,w), зависит только от параметров частицы; его называют константой седиментации данной частицы:
