Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование" -> 92

Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование — М.: Наука, 1981. — 288 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforeziultracentrifiguriya1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 86 87 88 89 90 91 < 92 > 93 94 95 96 97 98 .. 130 >> Следующая

Глава 4
РАЗДЕЛЬНОЕ ОСАЖДЕНИЕ ЧАСТИЦ (ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЕ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ)
В главе 1 было показано, что скорость осаждения частиц пропорциональна квадрату их линейного размера и разности плотностей частицы и среды (р—рс). Если стоит задача разделить центрифугированием смесь разнородных частиц примерно одинаковой плотности (значительно большей, чем плотность среды), то различие в плотностях частиц решающей роли не играет, а на первый план выступают размеры частиц. Пусть смесь частиц равномерно распределена по объему пробирки, как, например, в исходном гомогенате клеток. Если различия в линейных размерах частиц значительны, то скорости их оседания будут сильно различаться. При достаточно длительном центрифугировании, разумеется, все частицы осядут на дно пробирки. Но можно так подобрать скорость вращения ротора и время центрифугирования, что в осадке окажутся лишь самые крупные частицы, причем даже те из них, которые вначале находились вблизи мениска. Менее крупные частицы при этом почти целиком останутся в надосадочной жидкости (супернатанте), за исключением тех, которые вначале уже находились вблизи дна пробирки (они окажутся в составе осадка).
Для хорошей очистки супернатант осторожно сливают, осадок вновь суспендируют в объеме пробирки и повторяют центрифугирование. При этом загрязнение осадка крупных частиц более мелкими значительно уменьшается. Эту операцию можно повторить 2—3 раза. В свою очередь, при центрифугировании первого супернатанта на большей скорости или в течение более длительного времени можно отделить частицы средних размеров от еще более мелких, и т. д.
Итак, суть операции фракционирования частиц — в поочередном, раздельном их осаждении на дно пробирки. Этот процесс достаточно очевиден и хорошо знаком, однако необходимо все же дать некоторые практические рекомендации, относящиеся к суспендированию осадков. Так, очень нежелательно образование komikob, взвешенных в жидкости. Они могут долгое время не расходиться, удерживая внутри менее крупные частицы, от которых нужно избавиться при повторном центрифугировании. Чтобы избежать образования комков, надо с минимальным количеством буфера (или вовсе без него) долгое время растирать осадок стеклянной палочкой по стенке пробирки. Палочка должна быть не слишком тонкой (всего в 3—4 раза меньше по диаметру, чем пробирка) и заканчиваться ровной сферой, без каплевидного утолщения. Осадки могут быть и невидимы, но их все равно следует растирать. При центрифугировании в угловом роторе следует заметить, какая сторона пробирки была наиболее удалена от оси во время вращения ротора, и растирать невидимый осадок вдоль образующей этой стороны. С этой целью целесообразно предварительно пометить краской пробирки в одной точке снаружи и устанавливать их в ротор меткой наружу.
Раздельное осаждение частиц, очевидно, будет более эффективным, если не весь объем пробирки заполнен смесью, а между препаратом и дном пробирки (в бакет-роторе) находится «пустой» слой, через который мелкие частицы не успеют пройти за время центрифугирования. Это обеспечит полное выделение крупных частиц за одно центрифугирование. Чтобы во время нанесения препарата на «пустой» слой жидкости не происходило их смешивания, эта жидкость должна быть более плотной, например можно использовать раствор сахарозы.
В некоторых случаях используют и различие плотностей частиц, вводя в «пустой» слой достаточно концентрированный раствор сахарозы, сходный с частицами по плотности. В этом случае разность (р—рс) начинает играть важную роль. Продолжительность центрифугирования приходится, естественно, увеличить, зато степень очистки может быть очень высокой. Иногда (например для мембран) удается подобрать концентрацию раствора сахарозы в «пустом» слое так, что его плотность оказывается ниже плотности одних частиц и выше плотности других. Последние вообще не могут войти в плотный слой сахарозы и собираются на его границе. Можно создать не одну, а две или
три такиё границы и а ходе центрифугирований «рассортировать» по ним частицы в соответствии с их плавучими плотностями. Однако все это можно осуществить только в бакет-рото-рах. В угловых роторах частицы сначала оседают на стенку пробирки, а уже потом в виде сгустков соскальзывают на ее дно.
Выбор ротора для раздельного осаждения частиц обусловлен объемом центрифугируемой жидкости, размером частиц (константой седиментации s20.w — см. ниже) и необходимостью по возможности сократить время центрифугирования. Последнее определяется максимально допустимой скоростью вращения ротора и его геометрией. Обычно фирма для каждого ротора указывает значение параметра К, учитывающего эти его характеристики. Зная значение К, можно легко рассчитать время центрифугирования t (в часах), необходимое для практически полного осаждения из всего объема пробирки частиц с константой седиментации s20w в невязкой (водной) среде при максимальной скорости вращения ротора: t=K/s10iW. Значения
s20>w измеряются в единицах Сведберга (см. ниже). Например, для ротора 50.2 Ti К=72, а для ротора 30 /С=209 (оба ротора могут быть загружены одинаково: 12 пробирок по 38,5 мл). Легко видеть, что осаждение рибосом (s20w=80) в роторе 50.2 Ti можно осуществить за 1 ч, а для ротора 30 потребуется около 2,5 ч.
Предыдущая << 1 .. 86 87 88 89 90 91 < 92 > 93 94 95 96 97 98 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed