Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
При различных денатурационных воздействиях отмечается увеличение интенсивности и разрешенности спектра белка [24, 25]. Например, для многих белков наблюдали увеличение разрешенности спектров в концентрированных растворах мочевины и в трифторуксусной кислоте, где происходит разрыв внутримолекулярных водородных связей и переход белковой молекулы из а-спиральной конфигурации в беспорядочный клубок (рис. 10). У рибонуклеазы с разрушенными водородными связями окисление дисульфидных сшивок еще больше увеличивает разрешенность спектра [26, 27]. В случае бычьего сывороточного альбумина
и альдолазы окисление дисульфидов почти не влияет на характер спектра. Возможно, что этот факт отражает различия в положении дисульфидных связей в этих молекулах.
Для синтетических полипептидов методом ЯМР исследованы переходы спираль — клубок в зависимости от вида растворителя [25, 28] и температуры [28]. Метод позволяет определить процент спирализации и его изменение в зависимости от условий среды.
Аналогично белкам и полипептидам характер спектров полинуклеотидов и нуклеиновых кислот и изменения спектров с изменением температуры позволяют установить наличие упорядоченной структуры и ее плавление [29,30]. Комплекс (полиА + полиУ) и двутяжевая ДНК при температуре ниже температуры плавления имеют слишком большую ширину линий, не обнаруживаемую спектроскопией высокого разрешения. Это обусловлено сильным ядерным диполь-дипольным взаимодействием в жесткой двуспиральной структуре этих соединений. При плавлении возникают пики, характерные для протонов мононуклеотидов.
Для полинуклеотидов в случае полиУ спектр незначительно отличается от спектра мононуклеотидов и не меняется с увеличением температуры. Для полиЦ характерны слабые изменения спектра с изменением температуры, а в случае полиА обнаруживаются заметные изменения спектра. Эти результаты свидетельствуют об отсутствии какой-либо упорядоченной структуры для полиУ, слабой упорядоченности в случае полиЦ и наличии определенной структуры для полиА, сохраняющейся частично вплоть до 60°. Получены первые результаты по температурной зависимости ЯМР-спектров растворимой РНК [29].
Таким образом, можно получить ценные результаты о вторичной и третичной структурах макромолекул по изменению их спектра ЯМР при действии различных агентов, изменяющих внутримолекулярные связи и, следовательно, характер внутримолекулярных движений.
И з у ч е н и е с к о р о с т е й процессов и молекулярного движения. ЯМР успешно применяется для исследования скоростей как очень быстрых обменных процессов, так и медленных процессов изотопного замещения.
При наличии обмена между химическими группами вид спектра ЯМР будет различным в зависимости от скорости обмена. Если среднее время жизни т данного ядра в каждой химической группе велико по сравнению со временем, затрачиваемым на переход, то будут наблюдаться два отдельных пика, соответствующих обеим химическим группам. Картина меняется, если скорость обмена настолько велика, что время жизни в каждом химическом состоянии много меньше времени перехода между ними.
В этом случае наблюдается одна узкая линия в положении, промежуточном между обеими группами (рис. 11). Положение этой линии смещается линейно в зависимости от концентрации той и
другой групп, совпадая в крайних точках с положением линий в отсутствие обмена. Положение резонансной линии можно измерить проще и гораздо точней, чем ее интегральную интенсивность. Поэтому ЯМР является удобным методом для измерения константы скоростей и порядка реакций, которые трудно исследовать другими способами. Наиболее удобны для изучения реакции со средним временем жизни реагирующих соединений между 0,1 и 0,0005 сек. Возможности этого направления в приложении к скорости биохимических процессов все еще недостаточно исследованы.
Рис. 11. Схематическое представление изменения формы резонансных линий при обмене протонов между двумя магнитно неэквивалентными положениями А и В для [А]/[В]=1 в зависимости от скорости обмена
а — % — 100 УТ (пб АВН)~1; б- т ~ ~ 10уТ(пИлвЯ)-1; в-т~/2Г (лблвЯ)-1; г — т ~ 0,01 У2
№авиГх
РйзВертна магнитного поля
Кинетика медленного изотопного замещения легко регистрируется по изменению площади сигнала с течением времени. Вишня и Саундерс исследовали кинетику обмена протонов NH-rpynn рибонуклеазы в D20 в кислой области [31]. Было обнаружено, что часть протонов обменивается гораздо медленнее других. Изучение этого явления привело авторов к заключению, что медленно обмениваемые протоны принадлежат гуанидиновым группам аргинина. При помощи ЯМР исследовали кинетику дейтерирования ряда белков и ее связь со стабильностью белковой молекулы и механизмом денатурации физическими и химическими агентами [32].
Взаимодействие между молекулами. При помощи ЯМР по изменению химических сдвигов, ширины линии
----) и значения Тt можно обнаружить и изучить специфиче-
Тг
ское и неспецифическое взаимодействие между молекулами и образование комплексов с металлами.
