Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
ш
N
Усилитель
высокой
частоты
Приемник
Гwepamop
Приемная система
Детектор Усилитель Регистратор
низкой
частоты
Детекторная система
Рис. 8. Блок-схема спектрометра ЯМР
Рис. 9. Спектрометр ЯМР высокого разрешения JNM-3 фирмы «Electron optics» — Япония
вещество добавляют небольшое количество эталонной жидкости или в качестве эталона используют сигнал от растворителя (внутренний эталон). Более предпочтительны внешние эталоны, когда эталонную жидкость запаивают в капилляр, который по-мещают внутрь ампулы с исследуемым веществом. Сдвиги, измеренные относительно тетраметилсилана как внутреннего эталона, часто выражают в т-шкале, определяемой соотношением
гы.д. = 10,00+ 5‘,
где 6* — сдвиг относительно Si(CHs)4 в 6-шкале.
Рассмотрим типичные приложения спектроскопии ЯМР высокого разрешения к биологическим проблемам.
Определение первичной химической структуры биологически -активных молёкул. Возможность определения химической структуры сложных молекул основана иа следующих положениях.
1. Место резонансной линнн в шкале химических сдвигов ха^ рактеризует электронное окружение ядра и соответствует определенным химическим группам. Это дает возможность идентифицировать отдельные химические группы в сложных молекулах.
2. Изучение распределения интенсивностей позволяет установить относительное содержание различных химических групп в молекуле.
3. Анализ сверхтонкого расщепления линии свидетельствует о характере и расположении ближайших соседей дайной химической группы.
Из-за отсутствия единого эталона возможны отклонения в положении химических сдвигов отдельных линий, однако области спектра, соответствующие определенным химическим группам, хорошо изучены и линии могут быть строго отождествлены. В настоящее время составлены таблицы химических сдвигов отдельных групп для многих природных соединений.
Как правило, в водных растворах не удается наблюдать ха* рактеристических пиков таких биохимически важных групп, как карбоксила, карбоиилгидроксила, амино-, имино-, амидо-, сульф-гидрильиой групп, так как происходит быстрый обмен протонов этих групп с протонами воды, причем интенсивный пик воды заслоняет значительную часть спектра. Поэтому обычно биологически важные соединения исследуют в растворах D2O и наблюдают при этом иеобмеииваемые с растворителем протоны.
Рассмотрим несколько примеров определения химической структуры биологически важных молекул методом ЯМР. Спектр ЯМР новой аминокислоты растений, выделенной из семян арбу* за, позволил идентифицировать в ее структуре пиразол и установить, что эта аминокислота является р—1-пиразолилаланином [9]. Кон, используя ЯМР в сочетании с другими методами, определил структуру и конформацию обнаруженного в РНК нового нуклеозида псевдоуридииа [10]. Спектр ЯМР был использован в установлении химического строения нового антибиотика псико-фуранина [11].
Другой аспект химического строения, решаемый методом ЯМР, заключается в установлении места протонизации в результате ферментативной реакции или обмена протона с растворителем.
Титрование амино- или карбоксильных групп аминокислот в результате протоннзации или депротоиизации вызывает изменение электронной плотности и сдвиг резонансных пиков протонов, присоединенных к близлежащим атомам углерода; эффект от более удаленных протонов значительно слабее (12]. Аналогичные кривые титрования получены для аминопроизводных пуринов и пиримидинов [7]. При этом наблюдают заметные сдвиги резонансных пиков необменнваемых протонов гетероциклического кольца, которые удалены от аминогруппы. Это .свидетельствует о том, что протоны присоединяются скорее к азоту «ольца, чем к аминогруппе. В случае адениниуклеозида и нуклеотида больший сдвиг С-2 протона согласуется с протонизацией азота пиримидина, вероятно N-1, в то время как в случае гуаниннуклео-тида большой сдвиг С-8 протона указывает, что происходит протонизация N-7 амидазольиого кольца, т. е. образуются структуры
21 Физические методы исследования белков
309
nh2
I
С N HN+/\/V
>CH
НС\Л/
N N
R-O-PO3
О
II
С N+H
h^NC\/n /
N N
R-O-PO3
Площадь сигнала, химический сдвиг и константы спин-спино-вого расщепления позволяют также сделать выводы о характере присутствующих таутомеров. Получены, например, данные по таутомерии восьми основных рибо- и дезоксирибонуклеозидов [13]. Результаты такого рода представляют особый интерес в связи с современными теоретическими представлениями о роли таутомеров компонент нуклеиновых кислот в процессе мутагенеза.
