Регуляция ферментативной активности - Коэн Ф.
Скачать (прямая ссылка):
уровне L-аспартата активация АТКазы будет стимулировать синтез UTP и СТР, уравновешивая тем самым ¦биосинтез пуринов и пиримидинов. Действие АТР и СТР на активность АТКазы можно сравнить с действием L-валина и L-изолейцина на активность L-трео-ниндезаминазы (рис. 2.2 и 2.4).
Другие механизмы, обеспечивающие уравновешивание образования UTP, СТР, АТР и GTP, функционируют на уровне СТР-синтетазы (рис. 2.9). Этот фермент аллостерически активируется GTP [32]. СТР в высокой концентрации ингибирует СТР-синтетазу, вероятно, путем конкуренции с ее субстратом UTP. Активирование же фермента с помощью СТР можно наблюдать при низких концентрациях UTP; в этом случае СТР функционирует, вероятно, подобно GTP. АТР является субстратом СТР-синтетазы, а также трех последующих ферментов пиримидинового пути (рис. 2.9).
Фермент, предшествующий в метаболическом пути АТКазе, — карбамоилфосфат—синтетаза (рис. 2.9) — также регулируется как пуриновыми, так и пиримидиновыми нуклеотидами [33—35]. UMP, UDP и UTP
ингибируют его, а пуриновые нуклеотиды — IMP, GMP и АМР — вызывают активацию этого фермента. У Е. coli карбамоилфосфат участвует в образовании ц>итруллина из орнитина в цепи реакций биосинтеза L-аргинина (рис. 2.9). При избытке аргинина орнитин не синтезируется, поскольку аргинин ингибирует N-аце-тил, L-глутамат—синтетазу и таким образом блокирует первую стадию пути, ведущего к образованию орнитина (рис. 2.9). Итак, наличие в ростовой среде аргинина приводит к тому, что карбамоилфосфат используется только для биосинтеза пиримидинов, и первым ферментом пиримидинового пути становится карбамоилфосфат—синтетаза, а не АТКаза. То обстоятельство, что карбамоилфосфат—синтетаза in vitro ингибируется уридиновыми нуклеотидами, и в первую очередь UMP, указывает, что в условиях избытка аргинина первичная регуляция биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов осуществляется на стадии, контролируемой именно данным ферментом, а не АТКазой. Если аргинина в среде мало, то концентрация орнитина повышается. Он аллостерически активирует карбамоилфосфат—синтетазу и снимает ингибирование, вызываемое UMP [33, 35]. В этом случае первичную регуляцию пиримидинового биосинтеза осуществляет, по-видимому, АТКаза. Описанная ситуация иллюстрирует интересный принцип регуляции метаболизма. Во всех случаях метаболический путь регулируется ферментом, катализирующим лимитирующую стадию, однако в зависимости от метаболического состояния клетки эта стадия может смещаться.
Первоначально представлялось весьма неожиданным, что именно СТР, а не UTP ингибирует АТКазу по принципу обратной связи, поскольку в условиях избытка СТР и ограниченности уридинового пула АТКаза будет ингибирована и не сможет обеспечить клетку UTP. Это приведет к остановке клеточного роста, ибо СТР может использоваться для синтеза РНК лишь в том случае, когда его количество примерно равно количеству UTP [28]. Однако детальный анализ ингибирования АТКазы с помощью СТР показывает, что in vitro в условиях избытка карбамоилфос-
фата это ингибирование никогда не превышает 85% [28]. У бактерий с недостатком UMP и UTP создается высокий уровень карбамоилфосфата (карбамо-илфосфат—синтетаза не ингибирована) и, несмотря на большой избыток СТР, промежуточные соединения1 будут использоваться для образования UTP. Данных
о наличии второй АТКазы, которая бы не ингибировалась СТР и находилась под контролем уридинового пула, в настоящее время не имеется. Приведенный пример показывает, каким образом количественный анализ действия аллостерического эффектора позволяет выяснить механизм регуляции in vivo.
2.9. Структура АТКазы: индивидуальные каталитические и регуляторные субъединицы в одном ферменте
В 1965 г. Герарту и Шахману в эксперименте, ставшем уже классическим [37], удалось осуществить диссоциацию АТКазы (коэффициент седиментации 11.7S) на два компонента — 5,8 S и 2,8 S. Их изучение показало, что компонент 5,8 S обладает каталитической, активностью, но при этом не ингибируется СТР и не способен к активаций АТР; у компонента 2,8 S каталитическая активность отсутствует, однако сохраняются связывающие участки для СТР и АТР. После рекомбинации между 2,8 S и 5,8 S чувствительность компонента 5,8 S к ингибированию СТР восстанавливается. В настоящее время установлено, что компонент 5,8 S (Мг=100 000) является тримером, состоящим из трех идентичных каталитических (С) субъединиц, а компонент 2,8 S (Мг=34 000) — это димер, образованный двумя идентичными регуляторными (R) субъединицами. llJS-АТКаза (Мг=300000) имеет структуру R6C6. и диссоциирует следующим образом [38]:
Нвсв 3^2 + 2С3.
Трехмерная структура АТКазы была определена методом рентгеноструктурного анализа с разрешением
0,3 нм; упаковка субъединиц показана на рис. 2.12, Установлено, что для этого фермента характерна сим-
Рис. 2.12. Схема расположения субъединиц в молекуле аспартат-транскарбамоилазы; вид в направлении, перпендикулярном оси симметрии третьего порядка. Показаны также оси второго порядка, проходящие через регуляторные димеры. Каталитические и регуляторные цепи условно показаны в виде сфер. Треугольники, образованные крупными сферами, — каталитические триме-ры; небольшие сферы (затененные) -^-регуляторные димеры.
