Регуляция ферментативной активности - Коэн Ф.
Скачать (прямая ссылка):
У Е. coli из общего предшественника 3-дезок-си-0-арабиногептулозонат-7-фосфата (ДАГФ) синтезируются три ароматические аминокислоты; этот биосинтетический процесс схематически изображен на рис. 2.7. Охарактеризованы три ДАГФ-синтетазы, одну из которых ингибирует L-фенилаланин, вторую — L-тирозин, третья же синтетаза по типу обратной связи не ингибируется, но синтез ее репрессируется L-триптофаном [15]. После ответвления пути биосинтеза триптофана функционируют две хоризматмутазы,
одну из которых подавляет L-фенилаланин (хоризмат-мутаза Р), а другую — L-тирозин (хоризматмута-за Т) [16]. Эти примеры показывают, что функционирование двух или более ферментов, катализирующих одну и ту же биохимическую реакцию (изоферментов), представляет собой обычный механизм, регулирующий разветвленные метаболические пути у бактерий.
2.6. Бифункциональный фермент аспартаткиназа—гомосериндегидрогеназа; полифункциональные ферменты и полиферментные комплексы
При изучении бактериальных мутантов, которые выделяют большие количества L-треонина в ростовую среду, неожиданно было обнаружено, что оба фермента — треонинчувствительная аспартаткиназа и трео-нинчувствительная гомосериндегидрогеназа — частично (или полностью) нечувствительны к ингибированию L-треонином [11]. Поскольку одиночная мутация одинаково влияла на обе активности, можно было сделать заключение, что эти ферменты имеют по крайней мере общую полипептидную цепь. Данное предположение согласовывалось с результатами кинетических исследований; было показано, что L-аспартат и АТР — субстраты аспартаткиназы — ингибируют in vitro активность гомосериндегидрогеназы, a NADP и гомосерин — продукты гомосериндегидрогеназной реакции — ингибируют аспартаткиназу. Далее, NAD PH — субстрат гомосериндегидрогеназы — защищает от тепловой денатурации ингибируемую треонином аспартаткиназу, но не защищает ту аспартаткиназу, которую ингибирует лизин. Убедительным доказательством того, что обе активности связаны с одним белком, послужили опыты, показавшие, что данные активности не разделяются при фракционировании белков и что конечный продукт очистки является белком гомогенным. Этот белок был назван аспартаткиназа I—гомосериндегидрогеназа I. Он имеет мол. массу
*Mr)» 350000 и состоит из четырех идентичных субъединиц, удерживаемых в комплексе нековалентными связями (17, 18]. Следовательно, обе каталитические активности связаны с одной полипептидной цепью. Аналогичным образом было показано, что активности аспартаткиназы и гомосериндегидрогеназы, репрессируемые при росте на среде, содержащей L-метионин, также принадлежат одному белку, который получил название аспартаткиназа II—гомосериндегидрогеназа II. Ингибируемая лизином аспартаткиназа была названа аспартаткиназой III [11].
При инкубации бифункционального фермента аспартаткиназа I—гомосериндегидрогеназа I с химо-трипсином аспартаткиназная активность исчезала, а гомосериндегидрогеназная активность не ингибировалась L-треонином. Фрагмент, обладающий десенсити-зированной гомосериндегидрогеназной активностью (7ИГ=55000), был выделен; методом анализа концевых групп аминокислот показано, что этот фрагмент занимает N-концевую область полипептидной цепи. В литературе описан еще один мутант по аспартаткиназе I—гомосериндегидрогеназе I, который обладал нормальной аспартаткиназной активностью, чувствительной к ингибированию L-треонином, но был лишен гомосериндегидрогеназной активности. Мутантный бедок был выделен (Мг=47 000); показано, что он занимает С-концевую область полипептидной цепи. Данная мутация относится к типу ochre; укорочение полипептидной цепи обусловлено преждевременной термина-цией ее синтеза [19]. Выделение и исследование поли-пептидных фрагментов показало, что две ферментативные активности присущи разным участкам одной полипептидной цепи (рис. 2.8). Поскольку каждый из фрагментов обладает определенной активностью с неизмененной субстратной специфичностью, можно сделать заключение, что полипептидная цепь свернута в два глобулярных домена, каждый из которых в изолированном виде обладает активностью.
1 Мт — относительная молекулярная масса, Eur. J. Biochem., J44, 1, 1—4 (1981). — Прим. перев.
NH2-Met-Arg АК 90,000 ГД Gly-Val-COOH (1)
NH2 -Met-Arg 47000 АК
^55000 ГД___Gly-Val-COOH (3)
'Рис. 2.8. Структура аспартаткиназы I — гомосериндегидрогена-зы I из Е. coli К12. 1 — нативный фермент; 2— N-концевой фрагмент «ochre^-мутанта, обладающий аспартаткиназной (АК) активностью; 3 — С-концевой фрагмент из хнмотриптнческого гнд-•ролнзата, обладающий гомосериндегндрогеназной (ГД) активностью.
В настоящее время идентифицировано большое число бифункциональных ферментов, у которых с одной полипептидной цепью связаны две активности. К числу таких ферментов относятся первые два фермента биосинтеза триптофана у Е. coli (рис. 2.7) — антранилатсинтетаза и антранилат-(ФРПФ)—фосфо-рибозилтрансфераза [20]; другие аналогичные примеры приведены в гл. 4 и 5. Более того, были обнаружены полифункциональные ферменты, у которых с одной полипептидной цепью связаны не две, а большее число активностей. Такая ситуация, вероятно, чаще встречается у эукариот, чем у прокариот. Например, в клетках млекопитающих первые три фермента биосинтеза пиримидинов — карбамоилфосфатсинтетаза, аспартат-транскарбамоилаза и дигидрооротаза (рис. 2.9) — связаны с одной полипептидной цепью (Мг=215 ООО) [21], а у плесени Neurospora crassa пять ферментов, катализирующих последовательные реакции синтеза ароматических аминокислот, в ходе которых происходит превращение ДАГФ в 5-енолпирувоилшикимат (рис. 2.7), принадлежат одной полипептидной цепи с Мг=165 ООО [22]. В клетках млекопитающих все семь ферментов, участвующих в синтезе длинноцепочечных жирных кислот из малонил-СоА, входят в состав одного белка с Мг=250 000 [23].
