Проблема белка. Том 3: структурная организация белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001911-9
Скачать (прямая ссылка):
Исходными в анализе инсектотоксина служили наборы оптимальных конформаций свободных монопептидов, полученных из расчета соответствующих метиламидов N-ацетил-сх-аминокислот. На их основе были рассчитаны конформационные состояния перекрывающихся дипептидных фрагментов. Низкоэнергетические варианты всех возможных форм основной цепи и шейпов дипептидов использованы в расчете более сложных участков молекулы. Ниже мы остановимся на некоторых узловых моментах конформационного анализа инсектотоксина. Завершающая стадия расчета октапептида Met'-Thr8 заключалась в рассмотрении 130 исходных приближений 18 различных форм основной цепи. Минимизация выявила резкую дифференциацию конформаций по энергии; в широкий энергетический интервал UQбщ = 0-10 ккал/моль попали лишь восемь родственных структурных вариантов. Во всех случаях боковые цепи остатков Cys2 и Cys5 находятся далеко друг от друга и принудительное сближение атомов Сопровождается значительным повышением энергии.
Исходные 354 структурных варианта гексапептида Cys16-Lys21 сформированы из конформационных состояний перекрывающихся по трем остаткам фрагментов Cys16-Cys20 и AlaI8-Lys21 с Uo6lll =s 6,0 ккал/моль (см. рис. III.20). Они имели 76 форм основной цепи, распределяющихся по
1 2 3 1 5 6 7 S 9 101112 П 1415 16 17 IB 19202122 2324 2526272в29303/32333* JSJ6 Mrt Cys Htt Pro Ci|sPhelHrThr-Jr5frfk(>t1ttM(iein61itCij»Ar^kliiCi|s(jj»li(stli/Arg6l|jlijs{usfhetli(<W6ln(jjsltuCijsCb(Tijiik5p
Рис. Ill 20 Схема конформационного анализа молекулы инсектотоксина I,
всем в принципе возможным для гексапептида 32 шейпам. Минимизация энергии при варьировании двугранных углов ср, у и %i свидетельствует об отсутствии очевидного преимущества какой-либо формы или шейпа пептидного скелета. Относительной энергией от 0 до 8,0 ккал/моль обладают 118 конформаций 36 форм основной цепи 20 различных типов. Сближенность атомов S(i6> и S(20) наблюдается у конформаций следующих трех форм: B16-R17-R18-B19-B20 (effe), B16-B17-B18-L,9-B20 (efef) и B16-B17-B18-L19-B20 (ее/е). Однако возможность образования дисульфидной связи S(]6)-S(20) здесь чрезвычайно мала. Все варианты первых двух форм имеют высокую энергию, а у представителей третьей формы создание S-S-связи неизбежно сталкивается с необходимостью изменения положения боковой цепи Arg17, что ведет к резкому повышению энергии Конформации последнего типа низкоэнергетичны только у линейной последовательности. Цикл с дисульфидной связью между Cys16 и Cys19 может быть создан на основе структуры с формами B16-B17-Li8-B19 (е/е) и B'6_r17_ri8_r19 (eff). Состояния шейпа е/е имеют высокую энергию, а образование мостика в случае eff сопровождается нарушением стабилизирующих контактов и даже возникновением неблагоприятных взаимодействий. Поэтому мостик S(16)-S(19) нереален, как и S(i5)-S(29). Невозможно образование дисульфидной связи и между смежными остатками Cys19 и Cys20 (см. ниже). На малую вероятность S-S-валентного связывания на участке инсектотоксина Cys16-Lys21 указывает также наличие незначительной энергетической дифференциации конформаций.
Иная ситуация имеет место у фрагмента Cys26-Cys33. Минимизация 100 исходных структур 64 шейпов пептидного скелета участка Cys26-Cys33 выявила их резкое различие в стабильности. В интервал 0-5,0 ккал/моль попадает всего пять конформаций, причем четыре из них, самые предпочтительные (1/общ = 0-1,3 ккал/моль), имеют идентичное конформационное состояние на участке Cys26-Cys31, отвечающее глобальной структуре свободного гексапептида. В самых выгодных конформациях линейного октапептида Cys26-Cys33 участок Cys26-Cys31 представляет собой жесткую нуклеацию, a Cys3I-Cys33 - лабильную часть. В нуклеации расстояние между атомами S боковых цепей Cys26 и Cys3! составляет -3,6 А. Образование между ними валентной связи S-S, т.е. сближение до 2,04 А, сопровождается незначительным изменением геометрии, которое не приводит к нарушению стабилизирующих невалентных взаимодействий, сложившихся в оптимальной конформации линейной последовательности Cys26-Cys31. В то же время создание S-S-связи между Cys26 и Cys33, как и между Cys31 и Cys33, стерически невозможно. Таким образом, конформационный анализ фрагментов Met'-Thr8, Cys16-Lys21 и Cys26-Cys33 сократил количество возможных у инсектотоксина систем дисульфидных связей со 105 до следующих шести (приведены номера остатков Cys) (см. рис. Ш.20):
I 2-16 5-19 20-33 26-31,
I 2-16 5-20 19-33 26-31,
ш 2-19 5-16 20-33 26-31,
IV 2-20 5-16 19-33 26-31,
V 2-19 5-20 16-33 26-31,
VI 2-20 5-19 16-33 26-31.
Следующим этапом анализа инсектотоксина I] явилось рассмотрение конформационных состояний гексадекапептидного фрагмента Ala18-Cys33 и оценка возможностей образования дисульфидной связи между Cys33 и Cys19 или Cys20. Ввиду сложности центрального участка Lys21-Lys25 расчет этого фрагмента включал большое число стадий. На последней стадии было рассчитано более 100 конформационных состояний AlaI8-Cys33, представляющих собой комбинации низкоэнергетических вариантов Cys16-Lys21, Lys21-Phe27 и Cys26-Cys33. В интервал 0-5,0 ккал/моль попало только три, а в интервал 0-10,0 ккал/моль - 18 конформаций. В четырех из них атом СР остатка Cys33 сближен за счет невалентных взаимодействий менее чем на 10 А с атомом СР остатка Cys19 или Cys20 (согласно экспериментальным данным, это расстояние при наличии дисульфидной связи составляет -3,8 А при угле xs~s ± 90° и 4,8 А при %s~s 180°). Одна из этих конформаций имеет низкую энергию ((/общ = 2,0 ккал/моль), а три Других - более высокую (6,5-8,0 ккал/моль). Все попытки образовать у них, как и у других конформаций с ?/общ ^ 10 ккал/моль, дисульфидную связь между остатками Cys33 и Cys19 оказались безуспешными. Сближение атомов S(33) и S(19) на валентное расстояние приводило к резкому увеличению энергии или вследствие рассогласованности ранее сложившихся стабилизирующих взамодействий, или из-за возникновения неблагоприятных контактов.
