Люминесцентный анализ - Шлезингер М.А.
Скачать (прямая ссылка):
Xl _ х .
~Bi~ ь ]
где т1? Вг **)- время жизни возбужденного состояния и выход в растворе, а т и В - то же в коллоидной фазе.
*) Формула элементарной ячейки цепи полистирола -С - С -.
О Н
**) Поскольку т| является общепринятым обозначением для коэффициента вязкости, здесь для выхода принято обозначение В (а не т], как в других главах в соответствии с ГОСТ 7601-55).
3]
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ПРЕДЕЛЬНОЙ ПОЛЯРИЗАЦИИ
339
Определенные таким способом значения 'v сопоставлены с данными, полученными по осмотическому давлению. Результаты совпадают с точностью ~ до 10%. Авторы считают, что предлагаемый метод определения размеров коллоидных частиц может быть использован для растворов весьма малой концентрации, где неприменимы осмометрические, вискози-метрические и нефелометрические методы.
Большой интерес представляют работы, появившиеся в последние годы, в которых метор поляризованной флуоресценции применен к исследованию белков и других биологических и биохимических объектов. Среди них особого внимания заслуживают работы Вебера. В первой из них [27] проведены теоретические расчеты деполяризации люминесценции для случая эллипсоидальных молекул, у которых имеются три разных характеристических времени вращательной релаксации, соответствующих трем осям эллипсоида. Эти расчеты учитывают хаотичность ориентации излучающих осцилляторов относительно осей молекул. Последнее существенно во всех случаях, когда флуоресцируют молекулы, связанные с крупными нефлуоресцирующими частицами. Кроме этого, расчеты учитывают также и ту деполяризацию, которая обусловливается колебаниями осцилляторов в молекуле, а также возможность присутствия в растворе нескольких флуоресцирующих компонентов.
В работе тщательно проанализированы возможные экспериментальные ошибки и способы их устранения, в частности предложен оригинальный метод проверки градуировки компенсаторов.
В других работах [31] Вебер применяет эту разработанную им методику к исследованию протеинов - яичного и сывороточного (ovalbumin и serum albumin). Макромолекулы протеинов вследствие своих значительных размеров имеют настолько большое время вращательной релаксации, что флуоресценция должна иметь значительную поляризацию даже в маловязких, например водных, растворах. Однако сами протеины не флуоресцируют, и для того, чтобы применить методы, о которых идет речь, необходимо "метить" молекулы протеинов маленькими молекулами флуоресцирующего вещества (как это сделал Синглетерри с коллоидными частицами).
Этого можно достигнуть одним из следующих способов:
1) связыванием малых молекул ковалентной связью с последующим удалением из раствора флуоресцирующих молекул, оставшихся несвязанными, обычными методами очищения протеинов;
2) адсорбцией флуоресцирующих молекул на протеине, также с последующим удалением тем или иным способом несвязанных молекул, если бы таковые оставались;
3) можно, наконец, применять в качестве "метки" такие вещества, которые флуоресцируют только в адсорбированном состоянии.
Вебер пользовался в своих работах первым способом.
Присоединение флуоресцентной молекулы не должно вызывать значительного химического изменения протеиновой молекулы, а образующиеся комплексы и их флуоресценция должны быть стабильны в значительном интервале температур и pH.
В качестве флуоресцентного вещества, отвечающего поставленным требованиям, был выбран 1-диметил-аминонафталин-5-сульфонил-хлорид.
Поляризация флуоресценции комплексов была измерена Вебером в функции температуры, и по его формулам им были определены размеры и форма протеиновых молекул. Оказалось, что молекулы овальбумина близки к сферическим, а у серум-альбумина они представляют эллипсоиды с отношением осей 4:1.
22*
340
ПОЛЯРИЗАЦИЯ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ
[ГЛ. XX
В противоположность овальбумину поляризация серум-альбумина ¦зависит от pH среды; это связано, по-видимому, с наличием диссоциации.
Вебером исследовано также влияние на овальбумин температуры, кислот и других факторов. Наблюдаемое в ряде случаев увеличение времени релаксации вращения автор объясняет ассоциацией макромолекул, осуществляющейся, по-видимому, водородными связями. Не останавливаясь подробно на результатах этих работ, важных для биохимии, отметим только, что поляризационный метод оказался весьма плодотворным.
Опубликован и ряд других работ, в которых использована методика Вебера. Лоуренс [32] применил второй из указанных методов получения комплексов и с помощью его исследовал адсорбцию молекул различных флуоресцирующих соединений (производные 1- и 2-нафтиламина, производные акридина, флуоресцеина и родамина) на белковых молекулах. Из измерений поляризации и интенсивности люминесценции свободных и адсорбированных молекул красителей-он определил относительное число •связанных молекул и отсюда-константу диссоциации комплексов белок- краситель. Проведя сравнительные исследования на флуоресцирующих красителях с различной структурой, автор получил ряд сведений о механизме адсорбции молекул красителей на белковых молекулах.
Тот же метод Стейнер [33] применил к исследованию приготовленных им двухкомпонентных систем:
