Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Физика -> Шлезингер М.А. -> "Люминесцентный анализ" -> 164

Люминесцентный анализ - Шлезингер М.А.

Шлезингер М.А. Люминесцентный анализ — М.: Физ-мат литература, 1961. — 401 c.
Скачать (прямая ссылка): lumiscentniyanaliz1961.pdf
Предыдущая << 1 .. 158 159 160 161 162 163 < 164 > 165 166 167 168 169 170 .. 197 >> Следующая

ядра -зеленые, вакуоли - ораншево-краеные.
О применении люминесцентной микроскопии в фитопатологии при грибковых поражениях и при исследовании вирусных заболеваний см. гл. XIII, стр. 225, 236, 246.
5] ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ В ИММУНОХИМИИ 317
5. Люминесцентная микроскопия в иммунохимии
На новую высшую ступень люминесцентная цитохимия была поднята Кунсом с сотрудниками [4], разработавшими метод люминесцентно-меченых антител. В основном он заключается в следующем. В результате иммунизации животного соответствующим антигеном получают специфическую сыворотку; белковые их фракции, в которых преимущественно сосредоточены специфические антитела, обрабатывают флуорохромом и получают комплекс флуорохром - антитело, используемый для обнаружения соответствующего антигена. Наличие и локализация последнего в микроскопическом препарате выявляется в результате реакции антиген - антитело. Продукт этой реакции ярко люминесцирует и с помощью люминесцентного микроскопа может быть открыт даже в отдельных участках клеток [13, 14].
Для люминесцентной метки белков применяют флуорохромы: изоцианат и изотиоцианат флуоресцеина, некоторые производные родамина, в том числе изоцианат тетраметил родамина, хлорид диметил-нафтил-ами-но-сульфокислоты и ядерный красный прочный. Наиболее широко используется изоцианат флуоресцеина. Его растворяют в смеси диоксана с ацетоном и в таком виде соединяют с белком (обычно глобулиновой фракцией в количестве 5 мг флуорохрома на 100 мг белка) при температуре 0-5° С, перемешивая в течение 18 часов. Полученный конъюгат белка с флуоресце-ином освобождают от несвязавшегося красителя сначала с помощью диализа против забуференного при рН=9,0 физиологического раствора. Дальнейшая очистка от избыточного красителя производится переосаж-дением белка сульфатом аммония (4-5 раз), пока надосадочная жидкость не перестает люминесцировать. Препараты (мазки, суспензии, замороженные срезы), как фиксированные ацетоном, так и нефиксированные, приводят в соприкосновение с люминесцентно-меченым белком в течение 30 минут, промывают в физиологическом растворе (рН=7ч-7,5) и заключают в забу-ференный глицерин. Исследовать такие препараты лучше при ультрафиолетовом возбуждении. Соответствующие антигены при этом люминесцируют очень ярко светло-зеленым светом. Этот метод позволяет определять внутриклеточную локализацию чужеродных полисахаридов и белков, ферментов и гормонов, устанавливать антигенное родство тканей и клеток, быстро идентифицировать под микроскопом бактерии и вирусы.
Люминесцентно-иммунохимические методы дают возможность определять локализацию в клетках и изучать динамику образования антител. Так как получение люминесцентно-меченых антигенов трудно осуществимо (антигены принадлежат к разнообразным классам химических веществ), были предложены непрямые методы выявления антител [4, 15, 16]. Одним из таких методов является следующий. Препарат, содержащий искомое антитело, обрабатывается соответствующим немеченым антигеном; после того как произойдет образование комплекса антитело - антиген, этот же препарат обрабатывается люминесцирующим антителом, специфичным-по отношению к данному антигену. Образующийся при этом тройной комплекс легко выявляется благодаря интенсивной люминесценции.
Реакции с люминесцентно-меченым белком, в особенности специфическими белками - антителами, отличаясь высокой специфичностью, позволяют проводить тончайшие цито-иммунохимические исследования с точной локализацией биологически важных веществ и процессов.
318 ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ [ГЛ. XVIII
6. Люминесцентная микроскопия в вирусологии и микробиологии
01юминесцентную микроскопию эффективно используют теперь в вирусологии. Особое значение имеют здесь следующие флуорохромы: акридиновый оранжевый, примулин, аурамин, акридиновый желтый и бер* берин.
Для выявления крупных вирусов Хагеман [17] предложил примулин, дающий вполне удовлетворительные результаты [18]/ Метод состоит в том, что мазки, содержащие вирусный материал, фиксируют высушиванием в течение часа при 37° С, промывают в дистиллированной воде и снова сушат 1 час при 37°. Такие мазки затем обрабатывают раствором примули-на (1 : 500-1 : 1000) на 2%-ном водном растворе фенола. Левадити предпочитает обрабатывать препараты, содержащие вирусы, тиофлавином. За последнее время ряд авторов рекомендует применение акридинового оранжевого для флуорохромирования элементарных телец вирусов [19] как в свежих, так и фиксированных препаратах. Армстронг придает при этом особое значение активной кислотности раствора акридинового оранжевого; по его наблюдениям лучшие результаты получаются в интервале pH от 3,5 до 5,0.
<Tlo нашим данным, акридиновый оранжевый весьма пригоден для обнаружения внутриклеточных вирусных включений. По данным Авакяна с сотрудниками прижизненное флуорохромирование этим красителем крайне ускоряет и упрощает обнаружение патологических изменений в клетках культуры тканей, зараженных вирусом полиомиелита, что весьма полезно для диагностики этого заболевания./
Предыдущая << 1 .. 158 159 160 161 162 163 < 164 > 165 166 167 168 169 170 .. 197 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed