Люминесцентный анализ - Шлезингер М.А.
Скачать (прямая ссылка):
311
для возбуждающего излучения, т. е. для лучей именно тех длин волн, которые пропускаются первым светофильтром, располагают после объекта (чаще всего над объективом или окуляром микроскопа).
2. Должна быть обеспечена возможность концентрировать возбуждающее излучение с минимальными потерями энергии с тем, чтобы достигнуть возможно большей интенсивности возбуждения и соответственно яркости люминесценции в рассматриваемой точке препарата. В простейшем случае для возбуждения применяют обычный фабричный или самодельный осветитель для микроскопии, приспособленный для пользования низковольтными лампами накаливания точечного типа, точнее, лампами с возможно меньшей площадью накала. Наиболее подходящими являются малая кинопроекционная лампа К-30 (170 вт, 17 в) или лампа с воронкообразной спиралью СЦ-62 (100 вт, 12 в). Осветитель должен быть снабжен конденсором, сводящим расходящиеся лучи в параллельные.
В настоящее время промышленность выпускает специальные осветители для люминесцентной микроскопии, снабженные комплектами стеклянных светофильтров, что позволяет возбуждать лю- ^и?' Осветитель ОИ-17 для люминесцент-
иинесценцию и ультрафиолетовым и сине-фиолетовым светом. Такие осветители имеют
марку ОИ-18. Они предназначены для освещения объектов в проходящем свете при любых увеличениях микроскопов МБР-1, МБР-3 и МБ Д-4 (рис.74) и для возбуждения люминесценции в падающем свете на столике стереоскопического микроскопа МБС-1. Под маркой ОИ-17 выпускается комплект, состоящий из осветителя ОИ-18 и люминесцентного опак-иллюминатора. Аппаратура, входящая в этот комплект, обеспечивает, кроме уже упомянутых возможностей, возбуждение люминесценции в падающем свете через объективы микроскопа, вплоть до самых больших увеличений. Установка аппаратуры комплекта ОИ-17 для исследований с опак-иллюминатором представлена на рис. 75. С 1958 г. наша промышленность стала производить специальные большие люминесцентные микроскопы MJI-1 и МЛ-2 для разнообразных люминесцентных исследований при возбуждении как в проходящем, так и в падающем свете (сине-фиолетовом и ультрафиолетовом). Источником света в этих микроскопах служит мощная ртутно-кварцевая лампа сверхвысокого давления ДРШ-250. Микроскопы MJ1-1 и MJI-2- одни из лучших среди всех известных люминесцентных микроскопов (рис. 76). Опак-иллюминатор, установленный на обычном биологическом микроскопе или входящий в конструкцию микроскопов MJI, позволяет
312 ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ [ГЛ. XVIII
проводить комбинированные люминесцентные, фазо- и аноптрально-контрастные исследования.
Оптика микроскопов для люминесцентных исследований обычная, объективы желательны высокоапертурные, окуляры-с наименьшим из
возможных собственным увеличением. Для работы с иммерсионными объективами необходимы иммерсионное масло или другие жидкости, не обладающие собственной люминесценцией (кедровое масло обычно люминесцирует). Хорошие результаты дают водные иммерсионные объективы. Предметные и покровные стекла для люминесцентной микроскопии предварительно проверяют на отсутствие собственной люминесценции.
2. Использование собственной люминесценции объектов
Рис. 76. Люминесцентный микроскоп Собственная или так называемая
' первичная люминесценция присуща
только некоторым структурам в исследуемых микроскопических препаратах. Большинство веществ биологического происхождения имеет весьма мало интенсивную голубую, синюю или фиолетовую люминесценцию (максимумы в спектрах люминесценции многих из них лежат в ультрафиолетовой области спектра), поэтому возбуждать люминесценцию биологических объектов необходимо ультрафиолетовым светом, а в качестве "запирающего" светофильтра выбирать такой, который отсекает только ультрафиолет (например ЖСЗ; см. гл. VII).
Для микроскопического исследования собственной люминесценции биологических объектов желательно, избегать их соприкосновения с фиксирующими жидкостями; срезы из свежих тканей следует делать на замораживающем микротоме. Некоторые витамины (А, В2), пигменты (липофусцины, хлорофилл), а также и другие вещества под влиянием более или менее длительного освещения ультрафиолетовым излучением претерпевают фотохимические изменения и перестают люминесцировать. Поэтому микро-скоиирование таких веществ следует проводить по возможности быстро, часто меняя места наблюдения в исследуемом объекте.
3. Флуорохромы и флуорохромирование
У подавляющего большинства биологических объектов их собственная неяркая люминесценция не позволяет проводить люминесцентномикроскопические исследования и для избирательного выявления определенных структур применяют люминесцентные красители - флуорохромы.
_ Методы флуорохромирования, т. е. обработки объектов флуорохрома-ми, впервые были предложены Хайтингером [5] и в дальнейшем для различных целей разрабатывались многочисленными исследователями. В настоящее время известно несколько десятков органических соединений, с успехом используемых в качестве флуорохромов. К ним относятся
3}
ФЛУОРОХРОМЫ И ФЛУОРОХРОМИРОВАНИЕ
313
красители: тиазоловые, ксантеновые, хинолиновые, азокрасители и особенно акридиновые производные. Хорошими флуорохромами являются некоторые естественные пигменты (хлорофилл, липохромы), алкалоиды (бербе-рин, хинин), углеводороды (бензпирен, дибензантрацен). Флуорохромы применяются в сильно разведенных водных или спиртовых растворах (от 1 : 1000 до 1 : 100 000). Углеводороды (бензпирен) растворяют в насыщенном водном растворе кофеина.
