Люминесцентный анализ - Шлезингер М.А.
Скачать (прямая ссылка):
ГЛАВА XVII
ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ. В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ
Люминесцентная микроскопия зародилась в начале этого века как разновидность ултрафиолетовой микроскопии [1]. О^на из первых работ с применением люминесцентной микроскопии в биологии была выполнена известным русским ученым М. А. Цветом в 1911 г. [1а]. Прогресс люминесцентной микроскопии в дальнейшем был связан с введением в практику флуоресцентных красителей, так называемых флуорохромов, с усовершенствованием аппаратуры, разработкой новых люминесцентно-цитохимических методов, изысканием новых областей ее применения. Основные принципы и методы применения флуорохромов были разработаны в свое время Хайтингером и его сотрудниками [2]. Введением в научно-исследовательскую и практическую работу превосходного флуорохрома акридинового оранжевого мы обязаны Штруггеру [3]. Усовершенствование аппаратуры шло преимущественно в направлении повышения поверхностной яркости источника света, возбуждающего люминесценцию, и улучшения светофильтров. Принципиально новые возможности открылись после изобретения Брумбергом и Гершгориным ахроматических отражательных объективов. Разработанный Брумбергом (в 1955 г.) специальный люминесцентный опак-иллюминатор, позволяющий значительно повысить яркость люминесценции микроскопических препаратов, открыл новые возможности и области применения люминесцентной микроскопии *).
*) Для освещения препарата возбуждающим светом сверху, со стороны наблюдения,?при флуоресцентной микроскопии потребовалось изменить устройство обычного опак-иллюминатора.
Первый флуоресцентный микроскоп с новым опак-иллюминатором был сконструирован Е. М. Брумбергом и С. А. Гершгориным в 1948 г. В последнее время нашей промышленностью выпускается новый прибор этого типа ОИ-17. Опак-иллюминатор укрепляется на микроскопе между штативом и тубусом. Основное отличие его от обычных опак-иллюминаторов состоит в применении над объективом селективного отражателя, имеющего разные коэффициенты отражения для лучей разных длин волн. В опак-иллюминаторе флуоресцентного микроскопа в качестве такого отражателя используют интерференционное делительное зеркало. Интерференционное делительное зеркало представляет собой стеклянную пластинку, покрытую с одной стороны системой нанесенных друг на друга очень тонких (порядка длины световой волны) слоев прозрачных веществ с чередующимися высоким и низким показателями преломления. Обычно на это зеркало-светофильтр наносится от 5 до 11 слоев.
Избирательное отражение и пропускание таким светофильтром лучей определенного спектрального состава происходит в результате интерференции света, отраженного разными слоями. Такой опак-иллюминатор выгодно отличается очень высоким, близким к единице, коэффициентом использования света, так как в нем возбуждающие люминесценцию световые лучи отражаются на 90%, а свет люминесценции сво-
310 ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ [ГЛ. XVI1J
В настоящее время люминесцентная микроскопия находит все более широкое применение в различных областях научной и практической работы: в вирусологии, микробиологии, гистологии (нормальной и патологической), в физиологии, ботанике, онкологии, радиобиологии, а также при проведении лабораторно-клинических анализов, в санитарных'и судебномедицинских исследованиях. Среди новых направлений большой интерес представляет предложенный в свое время Кунсом с сотрудниками [4] исключительно чувствительный люминесцентно-иммунохимический метод меченых антител. .
1. Аппаратура
Простая установка для люминесцентной микроскопии состоит из обычного лабораторного осветителя с лампой типа точечной, из кюветы, наполненной раствором серномедноаммиачной соли, и биологического микроскопа с желтым светофильтром на окуляре.
Рис. 74. Осветитель ОИ-18 для люминесцентной микроскопии, установленный для исследований в проходящем свете.
Аппаратура для люминесцентной микроскопии должна удовлетворять следующим двум основным требованиям.
1. Люминесцентное свечение микроскопического препарата должно быть тщательно отделено от лучей возбуждающего света, прошедшего сквозь препарат или отраженного от него. Для этого применяют скрещенные светофильтры (гл. VI, стр. 88); из них первый, прозрачный только в области длин волн 300-400 ммк (т. е. пропускающий возбуждающее ультрафиолетовое и сине-фиолетовое излучение), ставится по ходу светового пучка перед объектом; второй, "запирающий", непрозрачный
бодно (на 90%) через него проходит. Это свойство крайне ценно для люминесцентной микроскопии, особенно при больших увеличениях, когда важно полное использование света. В опак-иллюминаторе возбуждающий люминесценцию свет проходит через объектив микроскопа, т. е. объектив в этом направлении действует как конденсор. В силу этого яркость возбуждающего света будет возрастать (в четвертой степени) с увеличением апертуры объектива. Следовательно, в пределах полезного увеличения микроскопа, яркость люминесценции препарата заметно возрастает при микроскопи-ровании с большими объективами, особенно иммерсионными.
АППАРАТУРА
