Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Физика -> Альберт А. -> "Избирательная токсичность. Физико-химические основы терапии Том 2" -> 3

Избирательная токсичность. Физико-химические основы терапии Том 2 - Альберт А.

Альберт А. Избирательная токсичность. Физико-химические основы терапии Том 2 — М.: Медицина , 1989. — 432 c.
ISBN 412-26010-7
Скачать (прямая ссылка): izbiratelnayatoksichnostt21989.djvu
Предыдущая << 1 .. 2 < 3 > 4 5 6 7 8 9 .. 191 >> Следующая


До недавних пор очистка ферментов обычными методами занимала много времени, а выход чистого фермента был невелик. Появление афинной хроматографии позволило резко ускорить этот процесс и повысить его эффективность. При этом специфический ингибитор данного фермента связывается ковалентно с полимерным адсорбентом с помощью подвижного мостика, например группы CH2CH2. Связанный фермент с ингибитором накапливается в колонке, с которой затем его легко вымывают, изменив pH элюента [Cuatrecasas, Wilcheck, Anfin-sen, 1968].

Первым синтетическим ферментом была рибонуклеаза. Ее синтезировали как в растворе, используя классические методы органического синтеза [Hirschmann et al., 1969], так и твердофазным методом Меррифилда [Gutte, Merrifield, 1969].

Для установления структуры ферментов наиболее успешно применяют метод рентгеноструктурного анализа. Самые точные результаты были получены с использованием аппаратуры с высоким разрешением (до ~0,2 нм), несмотря на то, что это достаточно дорого и занимает немало времени даже при наличии самой современной компьютерной техники. Этим методом удалось установить строение примерно 100 ферментов.

9.0.1. Конформационная адаптация фермента к субстрату

Для того чтобы подчеркнуть способность субстратов и коферментов изменить конформацию ферментов (и наоборот), Koshland (1964) ввел термин «наведенное соответствие». Результаты рентгеноструктурного анализа самих ферментов в сравнении с данными, полученными для комплекса фермента с медленно реагирующим субстратом или коферментом, подтвердили эту гипотезу. Так, например, было установлено, что апофермент лактатдегидрогеназы значительно деформируется в присутствии

9 своего кофермента НАД; кроме того, этот фермент, плотно скрученный, в нормальном состоянии был распрямлен с помощью апофермента [Adams et al., 1970]. Еще раньше отмечалось, что при образовании связей с активными центрами лизо-цима конформация остатка ацетилглюкозамина переходит из формы «кресла» в форму «полукресла» [Blake et al., 1967]. В настоящее время известно, что активные центры фермента обычно состоят из двух или более аминокислотных остатков, расположенных в разных участках полипептидной цепи фермента. Например, для действия содержащегося в яичном белке фермента лизоцима на его субстрат в стенке бактериальных клеток (муреин, см. рис. 5.3, т. 1) необходимо, чтобы сблизились остатки 35 и 52 (глутаминовая и аспарагиновая кислоты соответственно) из разных ветвей фермента [Phillips, 1966]. Третичная структура лизоцима такова, что на его внутренней поверхности расположены преимущественно гидрофобные, а на внешней — гидрофильные группы. Такое строение типично для большинства ферментов.

С помощью рентгеноструктурного анализа было показано, что дрожжевая гексокиназа состоит из двух долей, образующих полость, в которую и попадает субстрат — глюкоза. При этом происходит смещение полипептидного остова фермента на 0,8 нм: две доли фермента смыкаются вокруг субстрата так, что снаружи остается лишь гидроксиметильная группа у атома C6 глюкозы [Steitz, Shoham, Bennett, 1981].

Уплотнение структуры фермента при взаимодействии с субстратом часто происходит и при связывании его с ингибиторами. Так, например, дигидрофолатредуктаза (разд. 9.3). — рецептор таких лекарственных веществ, как метотрексат (4.7), триме-топрим (4.9) и хлоридин (4.8), легко гидролизуется протеолити-ческими ферментами в отсутствие этих препаратов [Burchall, 1966; Hakala, 1966]. Следующие примеры конформационной адаптации (наведенного соответствия), каждый из которых обладает совершенно индивидуальным механизмом, позволяют показать единую природу этого явления (рис. 12.2). Рибонуклеаза образует компактную структуру, гидрофильную снаружи и липофильную внутри, со щелью для захвата субстрата. В активном центре His-12 и His-119 располагаются рядом [Kartha, Bello1 Harker, 1967]. Размеры сложенной молекулы рибонуклеа-зы примерно 3x3x3,8 нм (ОММ 15000). При насыщении субстратом, например цитидинфосфатом, один остаток гистидина образует связь с фосфатной группой, а другой — с сахаром. Аналогична третичная структура а-химотрипсина: в активном центре Ser-195 и His-57 из разных ветвей фермента расположены поблизости друг от друга [Matthews et al., 1967]. Гидрок-сильная группа серина участвует в алкоголизе пептидной связи, приводящем к образованию сложного эфира, который затем подвергается гидролизу, катализируемому имидазольным циклом гистидинового остатка.

10 Результаты рентгеноструктурного анализа с использованием ингибиторов фермента показали, что активный центр карбоан-гидразы человека расположен в полости глубиной 1,2 нм, на дне которой находится атом цинка, окруженный тремя гисти-диновыми остатками (His-94, His-96 и His-119) и одной молекулой воды. В активном центре происходит связывание углерода и сульфаниламидного ингибитора [Kannan et al., 1975].

С помощью рентгеноструктурного анализа (разрешение 0,2 нм) было изучено строение карбоксипептидазы А, важного фермента поджелудочной железы, гидролизующего только пептиды с гидрофобными боковыми цепями. Было обнаружено, что атом цинка, являющийся необходимым кофактором, находится в небольшом углублении на поверхности молекулы рядом с глубокой липофильной полостью. Он связан с тремя аминокислотными остатками His-69, His-196 и Glu-72. Фермент состоит из 307 аминокислотных ферментов и имеет OMM 34 500. Сравнение «контурных карт» фермента в присутствии и в отсутствие субстрата (глицилтирозина), припятствующего гидролизу, показало, что фенильная группа попадает в глубокую полость, вынуждая карбонильный атом кислорода пептида (субстрата) расположиться напротив атома цинка, теряющего при этом молекулу координационной воды. Свободная карбоксильная группа субстрата образует ионную связь с Arg-145, что вызывает смещение аргинина на 0,2 нм и соответственно разрыв близлежащих водородных связей. Эти изменения приводят к повороту свободной гидроксильной группы Tir-248 на 120 °С. При этом она входит в небольшое углубление, расположенное рядом с пептидной связью субстрата, и, вероятно, выступает в роли общего кислотного катализатора, участвующего в протониро-вании уходящей группы. Атакующим нуклеофилом в этом случае является, по-видимому, карбоксильная группа остатка Glu-270 [Lipscomb et al., 1969; Lipscomb, 1970; Breslow, Wernick, 1977]. Все эти изменения представлены на стереодиаграмме (рис. 9.1). Структуру гликопротеина — нейраминидазы вируса гриппа — установили с помощью рентгеноструктурного анализа [Varghese, Laver, Colman, 1983].
Предыдущая << 1 .. 2 < 3 > 4 5 6 7 8 9 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed