Инфекционные болезни национальное руководство - Венгеров Ю.Я.
ISBN 978-5-9704-1000-4
Скачать (прямая ссылка):
Вторая стадия ПЦР — циклическая амплификация — протекает поэтапно при определённой температуре реакционной смеси (рис. 5-21).
Образовавшиеся в каждом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для последующих циклов, при этом число копий ДНК нарастает в геометрической прогрессии (2П, где п — число прошедших циклов амплификации). Описанные процессы протекают в термоциклере — программируемом термостате,
ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ 87
1
I
2
1
Рис. 5-21. Схема цикла полимеразной цепной реакции: 1 — нативная двухцепочечная ДНК;
2 — денатурация ДНК при температуре 94 'С;
3 — гибридизация (присоединение праймеров при температуре 55 'С); 4 — синтез компле- 4 ментарной цепи ДНК при температуре 72 'С, образование двухцепочечной ДНК.
по заданной программе осуществляющем смену температур согласно числу циклов амплификации.
Визуализацию результатов ПЦР осуществляют электрофоретическим разделением продуктов реакции в агарозном геле или методом гибридизации ампликонов с комплементарным к определяемой последовательности олигонуклеотидным зондом, меченным флюоресцентной, ферментной или другой меткой. Принципиально новое направление развития регистрационных систем — использование оптических биосенсоров, позволяющих определять в ходе гибридизации в реальном режиме времени пикограммовые количества фрагментов нуклеиновых кислот, иммобилизованных на поверхности оптической кюветы.
Достоинства ПЦР:
о высокая чувствительность метода, позволяющая определять 10-1000 клеток в пробе;
о высокая специфичность — в исследуемом материале выявляют уникальный для данного возбудителя фрагмент ДНК;
? универсальность процедуры выявления различных возбудителей, что даёт возможность диагностировать несколько возбудителей в одной биопробе;
о- высокая скорость анализа — унифицированная обработка биоматериала и детекция продуктов реакции, а также автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4,5 ч;
? возможность проводить количественный анализ и определять число копий специфических последовательностей нуклеотидов в пробе, контролируя таким образом вирусемию или бактериемию (например, вирусную нагрузку при вирусных гепатитах или ВИЧ-инфекции);
? возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. ПЦР можно эффективно использовать для диагностики труднокультивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, её использование целесообразно для выявления возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.
88 МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
Материалом для постановки ПЦР могут быть кровь, сыворотка крови, лимфоциты, биоптаты, СМЖ, моча. При сборе крови для ПЦР важны следующие условия:
? нельзя использовать гепарин в качестве антикоагулянта, так как он ингибирует ферменты и снижает чувствительность реакции;
? для предотвращения свёртывания крови применяют ЭДТА или цитрат натрия;
? кровь нельзя помещать в холодильник (+4 °С);
о- для определения вирусной нагрузки транспортировку крови следует осуществлять в максимально короткие сроки (до 6 ч) при температуре +18-22 °С.
Метод ПЦР имеет свои ограничения, в частности, для диагностики инфекций, вызванных условно-патогенной микрофлорой. Высокая чувствительность ПЦР создаёт опасность получения ложноположительных результатов за счёт минимальных загрязнений ДНК окружающей среды лабораторий, регулярно выполняющих однотипные исследования. Это формирует строгие требования к режиму проведения анализа.
Гибридизация нуклеиновых кислот
Метод гибридизации нуклеиновых кислот, как и ПЦР, позволяет идентифицировать возбудителя в пробе без предварительного выделения. Для проведения анализа синтезируют одноцепочечный ДНК- или РНК-зонд, комплементарный специфическим нуклеотидным последовательностям возбудителя. Зонд метят изотопом, ферментом или другой легкораспознаваемой меткой. Исследуемый материал подвергают обработке в целях лизиса находящихся в биопробе микроорганизмов, выделения и денатурации ДНК. Далее проводят инкубацию зонда с исследуемым образцом и измерение количества меченой ДНК, вступившей в гибридизацию с ДНК, находящейся в исследуемой пробе. Реакция может происходить как на твердофазных сорбентах, так и в растворе, однако обязательна отмывка несвязавшегося меченого зонда. Чувствительность метода уступает ПЦР (103 микроорганизмов в пробе), что ограничивает его применение как диагностического теста, тем более что аналогичную чувствительность имеют иммунологические методы, выявляющие микробные антигены.
Глава 6
Инструментальные методы исследования
ЭЛЕКТРОКАРДИОГРАФИЯ
ЦЕЛЬ
Определение электрической активности миокарда.
ПОКАЗАНИЯ
Плановое исследование выполняют всем больным, госпитализируемым в инфекционный стационар. Внеплановое и экстренное исследование проводится при развитии или подозрении на поражение сердечной мышцы токсического, воспалительного или ишемического характера.
