Инфекционные болезни национальное руководство - Венгеров Ю.Я.
ISBN 978-5-9704-1000-4
Скачать (прямая ссылка):
78
А
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
+ ->
©о Л
У А 0 0
~Y~
Отсутствие повреждающего действия
Отсутствие цитопатогенного эффекта
+
00
0 0
О О 0 Ф
/
>
ч 3
Гибель лабораторного животного
Цитопатогенный эффект
Рис. 5-15. Схема проведения реакции нейтрализации для определения антител в сыворотке крови больного. Условные обозначения: 1 — сыворотка крови больного; 2 — суспензия вирусной культуры; 3 — однослойная культура клеток; 4 — лабораторное животное. А — реакция положительная, Б — реакция отрицательная.
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ С ПРИМЕНЕНИЕМ ХИМИЧЕСКИХ МЕТОК
Иммунологические реакции, такие, как иммунофлюоресценция, ИФА, радиоим-мунный анализ, иммунный блоттинг (ИБ), основаны на применении химических или физических меток (флюоресцирующие вещества, фермент-субстратные взаимодействия, радиоактивные изотопы) для детекции образовавшегося комплекса «антиген-антитело», что обусловливает большую чувствительность анализа по
ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ 79
сравнению с серологическими реакциями. Более высокая специфичность иммунологических реакций обусловлена возможностью применения моноклональных антител, характеризуемых высокой специфичностью к строго определённым участкам (эпитопам) анализируемых антигенов. Для иммунологических тестов необходимы специальное оборудование для проведения реакции и регистрации результатов, а также обученный персонал.
Иммунофлюоресцеитиый метод
Иммунофлюоресценция — люминесценция (свечение) при микроскопии в ультрафиолетовом спектре биологического объекта, предварительно обработанного меченными флюорохромом антителами. Иммунофлюоресценция разработана Кунсом в 1942 г. и применяется как метод экспресс-диагностики инфекционных болезней.
Иммунофлюоресценция — иммунохимический метод, сочетающий морфологический анализ флюоресцентной микроскопии со специфичностью иммунологических методов. Люминесцирующие сыворотки получают путём химической реакции между антителами иммунной сыворотки и флюоресцирующим красителем (флюорохромом). На практике используют флюорохромы, имеющие жёлто-зелёную, жёлтую и красную флюоресценцию.
Меченная флюорохромом сыворотка образует на поверхности клетки или ткани комплекс «антиген-антитело», который виден под микроскопом в ультрафиолетовых лучах, возбуждающих свечение флюорохрома.
Метод иммунофлюоресценции применяют в различных модификациях, используют прямой и непрямой варианты.
Метод прямой иммунофлюоресценции (РИФ — реакция иммунофлюоресценции, прямая иммунофлюоресценция) используют для определения антигенов: обнаружение бактерий и риккетсий в мазках, выявление вирусов в заражённых клетках, изучение клеточных антигенов. В случае бактериальной инфекции при наличии в препарате искомых микроорганизмов определяют ореол свечения по периферии микробных клеток. Анализ результатов реакции включает изучение морфологии возбудителя, характера и спектра свечения (рис. 5-16).
Метод РИФ применяют для диагностики урогенитальных инфекций (хламиди-оза, генитального и простого герпеса) и особо опасных инфекций (холеры, чумы, сибирской язвы).
Пример использования РИФ в целях выявления вирусных антигенов — диагностика бешенства у животных. Мазки-отпечатки мозга погибших животных обрабатывают люминесцирующей антирабической сывороткой. При положительном результате в протоплазме нервных клеток наблюдают глыбки ярко-зелёного цвета (тельца Бабеша-Негри) — скопления вирусных нуклеокапсидов.
На обнаружении антигенов вирусов в мазках-отпечатках со слизистой оболочки основана экспресс-диагностика гриппа, парагриппа и аденовирусной инфекции.
Рис. 5-16. Схема проведения реакции прямой иммунофлюоресценции: АГ — антигенсодержащий клинический материал; АТ — антитела стандартной агглютинирующей сыворотки крови; Ф — флюорохром.
АГ
АТ
Свечение комплекса «антиген антитело» при микроскопии в ультрафиолетовом спектре
80 МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
Метод непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ — реакция непрямой иммунофлюоресценции) обладает рядом преимуществ по сравнению с РИФ: возможностью определения антигенов и антител, большой чувствительностью и доступностью, так как с помощью одной меченой антиглобулиновой сыворотки можно обнаружить различные бактериальные и вирусные антигены.
При определении антигена на исследуемый препарат наносят диагностическую кроличью сыворотку. Образовавшийся комплекс «антиген-антитело» после отмывки от несвязавшихся антител визуализируют с помощью меченной флюорохромом антиглобулиновой (к иммуноглобулинам кролика) сыворотки. Для выявления антител на готовый тест-мазок наносят сыворотку крови больного, после отмывки комплекс «антиген-антитело» выявляют с помощью антиглобулиновой (к иммуноглобулинам человека) сыворотки (рис. 5-17).
Определение антител в сыворотке крови пациента в РНИФ используют для диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС), РНИФ с выявлением антигена в клиническом материале — для диагностики заболеваний, передающихся половым путём.
