Руководство по экспериментальной хирургии - Шалимов С.А.
Скачать (прямая ссылка):
Методика определения числа ЕА (без комплемента) или ЕАС-РОК аналогична, но для ее проведения необходимо готовить так называемую индикаторную систему. С этой целью вначале
Рис. 48. В-розетки, образованные лимфоцитами периферической крови собаки.
Фазовый контраст. Х180.
получают кроличью антисыворотку против эритроцитов морской свинки или человека (кролику внутривенно вводят сначала 10 мл, а через 6 и 16 ч после первой инъекции еще по 50 мл 10% взвеси эритроцитов морской свинки или человека, через 7 дней берут кровь, отделяют сыворотку, прогревают ее 30 мин при + 56°С и определяют титр антител в реакции гемагглютинации).
Затем к 4 мл 5% взвеси эритроцитов морской свинки или человека добавляют 4 мл кроличьей антисыворотки и инкубируют 30 мин при + 37°С. Эритроциты трижды отмывают изотоническим раствором хлорида натрия, осадок ресуспендируют в 4 мл раствора, добавляют 4 мл мышиной сыворотки, разведенной в 10 раз (для определения ЕАС-РОК), инкубируют 30 мин при Ч-37°С, трижды отмывают изотоническим раствором хлорида натрия, центрифугируют и готовят из осадка 5% взвесь эритроцитов в среде 199. Перед постановкой опыта эту взвесь разводят в 10 раз.
Реакция бласттрансформации лимфоцитов проводится для оценки функционального состояния лимфоцитов периферической крови. Основана на способности лимфоцитов трансформироваться под воздействием антигенов в бластные клетки, имеющие четкие морфологические отличия от лимфоцитов, находящихся в покое. Это крупные клетки с большим центрально расположенным ядром. Хроматин ядра диффузно распределен во всем его объеме, ядро содержит 2—3 ядрышка. Цитоплазма широкая,
х-х-х:
117
резко базофильная. В ядрах некоторых клеток видны фигуры митоза. К блаетам причисляются и лимфоциты с начальными признаками трансформации.
Чаще всего в качестве стимулятора используют фитогемаг-глютинин (ФГА), но, в принципе, с этой целью может быть применен любой антиген. Принято считать, что под воздействием ФГА трансформации подвергаются только Т-лимфоциты. Для изучения функционального состояния В-лимфоцитов применяют митоген лаконоса либо полисахаридную фракцию оболочки Pseudomonas aeruginosa, Е. coli и других грамотрицагельных микроорганизмов.
Методика постановки реакции бласттрансформации лимфоцитов: гепаринизированную кровь разливают по 0,5 мл в 4—5 силиконированных пробирок, добавляют 4,5 мл среды 199; первая пробирка служит контролем — это фоновая спонтанная бласттрансформация, во вторую вносят ФГА из расчета 0,1 мл/мл, в остальные — испытуемый антиген, в тех же объемах содержащий 0,2 мг белка; пробирки герметизируют и 72 ч инкубируют при +37°С; центрифугируют 15 мин при 1000— 1500 об/мин; снимают образовавшийся над эритроцитами беловатый слой, готовят мазки, окрашивают их по Паппенгейму и подсчитывают число бластов на 500 клеток.
На этом же принципе основан и метод смешанной культуры лимфоцитов, когда вместо ФГА или антигена в пробирку добавляют взвесь лимфоцитов другого животного. Это позволяет достаточно точно оценить степень совместимости донора и реципиента, а также ориентировочно прогнозировать время наступления и интенсивность криза отторжения аллотрансплантата. В качестве контроля уровня спонтанной бласттрансформации используют пробирки с кровью каждого из обследуемых, а также две пробирки, в которых раздельно культивируют лимфоциты каждого подопытного животного.
При проведении реакции смешанной культуры лимфоцитов-используют их чистую взвесь, выделенную из крови и имеющую концентрацию клеток 1—2-106/мл. Перед началом культивирования лимфоциты одного из двух подопытных животных обраба-тывают в течение 30 мин при +37°С митомицином С (16 мкг/мл) с тем, чтобы блокировать их собственный ответ на антигены-партнера. Затем в пробирку наливают 2 мл взвеси обработанных митомицином С лимфоцитов и 2 мл необработанных. Эта взвесь представляет собой 2-106 лимфоцитов в 1 мл среды 19& Пробирки герметизируют и подвергают инкубации 7 дней при* + 37 °С, после чего учитывают число бластных форм на 500 лимфоцитов.
Методика выделения лимфоцитов периферической крови. Существует много методов получения концентрированной и относительно очищенной от примеси других клеток суспензии лимфоцитов. Имея различные недостатки, они, в целом, дают сходные результаты, отличающиеся главным образом числом оставшихся*
118
во взвеси эритроцитов [Когут Г. И. и др., 1979]. Наибольшее распространение в лабораторной практике получил метод дифференциального центрифугирования в градиенте фиколл-верогра-фина.
24,4 г фиколла растворяют в 100 мл теплой дистиллированной воды, добавляют 49,9 мл 75% раствора верографина .и дистиллированной водой доводят объем смеси до 340 мл. Устанавливают плотность, равную 1,077, фильтруют, при необходимости стерилизуют путем автоклавирования и хранят при 4-4 °С. Берут 4—5 мг гепари,визированной крови, отстаивают ее в холодильнике и отсасывают образовавшийся над эритроцитами слой плазмы, содержащий лимфоциты, тромбоциты и другие клетки. В центрифужную пробирку вносят 2 мл фиколл-верографиновой смеси и по стенке осторожно наслаивают отсосанную плазму с клетками.
