Руководство по экспериментальной хирургии - Шалимов С.А.
Скачать (прямая ссылка):
Определение пропердина в сыворотке крови по Л. В. Новиковой и соавт. (1981). Исследуемую сыворотку разводят веро-нал-мединаловым буферным раствором (pH 7,4) от 1 : 10 до 1 : 320. В центрифужные пробирки вносят по 0,2 мл каждого разведения испытуемой сыворотки, 0,2 мл инсулина (3 мг сухого вещества) и 0,2 мл комплемента. В аналогичном ряду контрольных пробирок вместо инсулина добавляют по 0,2 мл буферного раствора. Инкубируют 1 ч при +37°С, 15 мин центрифугируют при 1500 об/мин и отсасывают по 0,3 мл надосадочной жидкости. К этим образцам добавляют по 0,2 мл стандартной гемолитической системы, 20 мин инкубируют при +37°С и учитывают результат. За титр пропердина принимают наибольшее разведение испытуемой сыворотки, когда еще видна отчетливая задержка гемолиза. ;
Определение фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови. Из вены берут в пробирку с гепарином 0,2 мл крови и добавляют 0,1 мл взвеси бактерий, полученной из суточной культуры на агаре, имеющей концентрацию один миллиард микробных тел в одном миллилитре. В качестве тест-культуры чаще всего используют эталонный штамм стафилококка № 209, но можно взять любую культуру в той же концентрации, например ту, что вызвала нагноение у данного подопытного животного.
Пробирку осторожно встряхивают и 30 мин инкубируют при + 37°С. Из образовавшейся над осадком эритроцитов лейкоцитарной взвеси делают мазки, фиксируют их и окрашивают по Романовскому—Гимзе. Определяют процент активно фагоцитирующих нейтрофилов и число фагоцитированных микробов, приходящихся в среднем на один нейтрофил, т. е. интенсивность фагоцитоза.
114
Кроме того, необходимо определить показатель завершенности фагоцитоза. Исследование проводят по методу 3. Е. Мату-сис и С. И. Пылаевой в модификации Е. А. Олейниковой и соавт. (1981). Непосредственно после добавления в пробирку с кровью микробной культуры и спустя 2 ч инкубации при -г37°С делают посевы на один из секторов мясо-пептонного* агара в чашке Петри. Подсчитывают число колоний микроорганизмов, определяя степень завершенности фагоцитоза в баллах от 0 (отсутствие роста) до 10 (сплошной рост), выделяя при этом 5 степеней: 1-я— высокая (рост 0,2 балла, коэффициент бактерицидное™ — величина, обратная логарифму числа выросших колоний,— 1,0—0,22); 2-я —средняя (рост 3—4 балла, коэффициент 0,81—0,45); 3~я — слабая (рост 5—6 баллов, коэффициент 0,44—0,32); 4-я — очень слабая (рост 7 баллов, коэффициент 0,31—0,29 при обязательном сплошном росте в контроле); 5-я — отсутствие завершенности фагоцитоза (рост 8—10 баллов, коэффициент 0,28—0,25).
JI. В. Новикова и соавт. (1981) рекомендуют вычислять еще эффективность фагоцитоза как интегральный показатель фагоцитарной активности нейтрофилов. Он представляет собой произведение трех величин: активности, интенсивности и завершенности фагоцитоза. Для изучения степени сенсибилизации клеток периферической крови эти исследования можно проводить в присутствии тканевых или бактериальных аллергенов, добавляя их в пробирку с кровью и микробной культурой по 0,1 мл.
Методы исследования клеточных факторов иммунитета
Определение аутобляшкообразующих клеток (АБОК) по Н. Н. Клемпарской (1969). АБОК — это клетки, продуцирующие аутогемолизины. Их число в крови у интактных животных, как правило, не превышает 3%. Методика их выявления: на предметное стекло наносят 2 капли (по 0,02 мл) свежецитратной крови; к одной капле добавляют 0,01 мл 4 % уксусной кислоты, к другой — 0,01 мл раствора Хенкса; каждую каплю тщательно перемешивают и накрывают покровным стеклом со смазанным вазелином краями, чтобы предотвратить растекание и подсыхание капли; инкубируют 18—20 ч при +4°С и 1 ч при комнатной температуре; в первой капле подсчитывают число ядросодержащих клеток, а в другой — число зон гемолиза вокруг ядросодержащих клеток. Число АБОК определяют по формуле:
число «бляшек» в 10 полях зрения
АБОК= ---• 100.
число кариоцитов в 10 полях зрения
Определение числа Т- и В-лимфоцитов в периферической крови (рис. 47, 48). Используют тест спонтанного розеткообра-зования лимфоцитов с нативными или сенсибилизированными антителами (ЕА), антителами с комплементом (ЕАС) эритро-
8*
х-х-хх-
•х-х-х-х
Ж
•" 7,1
йК&й
ш*
шшзш&т
ШШ
ШХ:
«жш
ШШЙМШтШШШВ.
шшш
шшт
Hi
::;х:х
::
рщш
Рис. 47. Т-розетки, образованные лимфоцитами периферической крови собаки.
Фазовый контраст. Х180.
цитами. Если в этих методиках в клинических исследованиях используют эритроциты барана или быка, то в эксперименте на собаках пользуются эритроцитами человека или морской свинки (Bowles Ch. et al., 1975]. Содержание Т-лимфоцитов соответствует числу Е-розеткообразующих клеток (Е-РОК), у собаки их 32—36 %, содержание В-лимфоцитов — числу ЕА-РОК или ЕАС-РОК (до 48 %) (см. приложение, табл. 13).
Для определения Е-РОК в центрифужную пробирку вносят 0,5 мл взвеси лимфоцитов (2 • 106/1 мл) и добавляют 0,5 мл 5 % взвеси эритроцитов морской свинки. Центрифугируют 3—5 мин при 800 об/мин, инкубируют 5 мин при +37°С и 30 мин при + 12°С, осторожно ресуспендируют и либо ведут подсчет розеток в камере Горяева, либо в нативной капле с добавлением акридина оранжевого на люминесцентном микроскопе, либо в мазках после фиксации в пробирке раствором глютаральдегида, метиловым спиртом и окраски по Романовскому—Гимзе. Учитывают лимфоциты, присоединившие не менее трех эритроцитов. Число Е-РОК выражают в процентах по отношению к 200 лимфоцитам. Абсолютное содержание их в 1 мм3 определяют по формуле: Х = число лейкоцитов в 1 мм3*процент лимфоцитов в формуле крови-процент РОК.
