Руководство по экспериментальной хирургии - Шалимов С.А.
Скачать (прямая ссылка):
Кариологический анализ метафазных клеток у собак представляет определенные трудности, так как, во-первых, методика их получения несколько отличается от принятой в клинике, а, во-вторых, типичным для собаки является диплоидный набор из 76 тело- или субтелоцентрических хромосом с постепенно уменьшающейся величиной от самой большой Х-хромосомы до самой маленькой Y-хромосомы, что не дает возможности идентифицировать ни отдельные хромосомы, ни их группы. В обеих половых хромосомах центромера расположена субметацентрично.
Методика получения метафазных клеток у собак разработана С. А. Хрусталевым (1966) и Т. П. Цессарской (1968). По мнению авторов, самым надежным гистологическим методом является кариологическая идентификация костномозговых клеток. Характерной особенностью препаратов костного мозга служит наличие гиперплоидных клеток, представляющих собой мега-кариобласты, из которых затем формируются мегакариоциты. В результате повторных эндомитозов в них образуются гигантские ядра, содержащие сотни хромосом.
Для получения метафазных клеток 1—2 мл костного мозга помещают в 20 мл глюкозо-солевого раствора (600 мг хлорида натрия и 700 мг глюкозы на 100 мл дистиллированной воды) с колхицином (2 мл 0,04 % раствора). Эту взвесь клеток 2—Зч инкубируют при +37°С, разводят в 5 раз 0,44 % раствором цитрата натрия и выдерживают 25—30 мин при комнатной температуре. Полученную клеточную взвесь центрифугируют 20 мин при 800—1000 об/мин, удаляют надосадочную жидкость, фиксируют клетки, добавляя по каплям спиртово-уксусную смесь (3 части абсолютного спирта и 1 часть ледяной уксусной кислоты) и оставляют в фиксаторе 1 ч при +4°С. Удаляют фиксатор, добавляют 60 % раствор уксусной кислоты, наносят каплю взвеси на охлажденное в сухом льду предметное стекло, подсушивают на пламени горелки и окрашивают ацетоорсеином. Метафазные клетки фотографируют при большом увеличении микроскопа и подвергают анализу.
112
Прямое или опосредованное участие реакций иммунитета в патогенезе ряда хирургических заболеваний или послеоперационных осложнений, установленное многочисленными исследованиями, требует использования иммунологических методов и в лаборатории экспериментальной хирургии. Описано огромное количество этих методов. Чтобы представить их в более или менее систематизированном виде потребуется отдельное издание. Вместе с тем, основываясь на собственном опыте и наблюдениях других исследователей, можно выделить определенный минимум простейших методик, владение которыми, по-видимому, обязательно для сотрудников такой лаборатории. Использование более тонких и сложных методов, требующих специальной аппаратуры, должно уже диктоваться потребностями конкретного исследования и, естественно, возможностями учреждения.
Основываясь на личном опыте и данных литературы, рекомендуем следующий минимальный перечень иммунологических методик, применение которых в комплексе с другими способами позволяет получить достаточно полное представление об иммунном статусе подопытного животного.
Показатели неспецифической иммунологической резистентности и гуморальных факторов иммунитета
Реакцию гемагглютинации и агглютинации микроорганизмов^
осуществляют следующим образом. Готовят разведения испытуемой сыворотки с изотоническим раствором хлорида натрия в соотношениях 1:2—1:512. В каждую пробирку вносят по 0,1 мл 2,5% взвеси эритроцитов барана, инкубируют 24 ч при + 5°С и учитывают результаты по максимальному разведению сыворотки, когда на дне пробирки образуется агглютинат ( + 4),. и по последней пробирке, в которой еще видны следы агглютинации эритроцитов (1 + ).
Для реакции агглютинации микроорганизмов вместо эритроцитов барана в каждую пробирку вносят по два миллиарда микробных тел убитой суточной культуры Е. coli, а затем их инкубируют 2 ч при +37°С и 20 ч при комнатной температуре. Учет проводят аналогичным образом.
Определение титра комплемента по 50 % гемолизу. Смешивают равные объемы 3 % взвеси эритроцитов барана и гемолитической сыворотки (кроличья антисыворотка против эритроцитов барана), разведенной по тройному титру (если исходный титр сыворотки 1:1500, то разведение должно быть 1:500), и 30 мин инкубируют при +37°С. Затем наливают в 5 пробирок по 0,1—0,2—0,3—0,4—0,5 мл исследуемой сыворотки, разведенной изотоническим раствором хлорида натрия в соотношении 1 : 10, доводят объем жидкости в каждой пробирке до 1,5 мл, доливая соответствующее количество раствора, и добавляют по 1,5 мл ранее приготовленной смеси эритроцитов барана с гемолитической сывороткой. Инкубируют 45 мин при 1500 об/мин и
8 Заказ № 418
113
определяют оптическую плотность с помощью ФЭК с зеленым фильтром против воды.
Одновременно ставят два контроля: 1,5 мл дистиллированной воды с добавлением 1,5 мл взвеси эритроцитов барана (100% гемолиз) и 1,5 мл изотонического раствора хлорида натрия с добавлением 1,5 мл взвеси тех же эритроцитов. Определяют оптическую плотность жидкости в первом контроле, что соответствует 100 % гемолизу. Этот показатель делят на 2 (50 % гемолиз).
Из показателей оптической плотности растворов в 5 исследуемых пробирках выбирают наиболее близкий по значению к оптической плотности 50 % гемолиза в первом контроле и делят его на показатель оптической плотности 100 % гемолиза. В таблице коэффициентов Мальтанера (см. приложение, табл. 12) отыскивают коэффициент, соответствующий полученной величине лизиса эритроцитов, умножают на 10 и в зависимости от того, какая пробирка взята для расчета, на 10—5—3,3—2,5 или 2. Полученное произведение соответствует содержанию комплемента в сыворотке крови, выраженному в 50% единицах.
