Антигельминтики: фармакология и применение - Архипов И.А.
ISBN 978-585941-305-8
Скачать (прямая ссылка):
После охлаждения в пробирку с образцом вносили 0,150 мл охлажденной реакционной смеси. Пробирку закрывали, перемешивали содержимое, обрабатывали ультразвуком, центрифугировали и выдерживали в холодильнике в течение 1 ч.
Условия хроматографирования проб с авермектином и обработка результатов: жидкостной хроматограф Ди Pont 8800 (США) с флуоресцентным детектором Kratos-Sthaeffel FS 950 (Англия); металлическая колонка Диасорб-130-С 16Е 250x4 мм, 6 мм («БиоХимМак», Россия); подвижная фаза метанол:вода (98 : 2); скорость подвижной фазы 2 мл/мин.; длина волн возбуждения 365, эмиссии 470 нм; время удерживания Н2Віб 16,6, Н2Віа 18,6 мин.
Содержание авермектина в анализируемых пробах рассчитывали по формуле (1), гдеХ- содержание авермектина в анализируемой пробе, нг/г; S\ - площадь пиков фракции H2Bia в стандарте, мм2; Si - площадь пиков фракции H2Bi6 в пробе, мм2; С -количество стандарта в пробе, вносимой в хроматограф, нг; V\ -объем пробы, вносимой в хроматограф (50 мкл); V2 - общий объем пробы (0,7 мл); Р - масса анализируемой пробы, г.
Для изучения фармакокинетики ивермектина разработаны разные методы его выявления в органах и тканях, сыворотке кро-
137
ви и молоке. Однако многие методы из-за своей сложности и недостаточной чувствительности малоэффективны.
А.В. Григорьев и др. (2004) разработали методику определения ивермектина в сыворотке крови животных и продуктах вете-ринарно-санитарного надзора после применения различных лекарственных форм на основе ивермектина.
Метод определения концентрации ивермектина в крови и молоке животных основан на определении количественного содержания флуоресцентного производного ивермектина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой с применением флуоресцентного детектора.
Подготовка проб заключается в экстракции ивермектина органическим растворителем из исследуемого образца животного происхождения, очистке путем твердофазной экстракции и получении флуоресцентного производного ивермектина обработкой трифторуксусным ангидридом в присутствии 1 -метил-имидазола.
Детектирование ведется по интенсивности флуоресценции при длинах волн возбуждения и эмиссии 365 и 470 нм, соответственно. Чувствительность метода составляет 2 нг в пробе, нанесенной на колонку.
Пробы крови в объеме 9 мл отбирали в центрифужные пробирки, содержащие 1 мл 3 % Ка2ЭДТА, 0,9 % NaCl и 500 нг абамектина. Полученные образцы центрифугировали 15 мин при 2000 об/мин. Затем 1 мл плазмы помещали в центрифужную пробирку, добавляли 2 мл метанола, тщательно перемешивали на Vortex и центрифугировали 30 мин при 6000 об/мин. Супернатант фильтровали через мембранный фильтр (размер пор 0,45 мкм) типа «Свиннекс» и наносили на патрон для твердофазной экстракции Chromabond С8 100 mg, предварительно промытый 1 мл метанола. Промывка патрона и нанесение образцов осуществляли самотеком. Раствор после патрона отбрасывали. Патрон сушили азотом 2 мин при 5 атм. и промывали 1 мл метилтретбутилового эфира. Элюат собирали в пробирку с притертой пробкой. В элюат добавляли 50 мкл 1-метил-имидазола, перемешивали, вносили 50 мкл трифторуксусного ангидрида, перемешивали еще раз и отстаивали до образования маслообразного осадка и просветления надосадочного слоя. Из надосадочного слоя осторожно отбирали 100 мкл раствора и переносили в пробирку с притертой пробкой, содержащую 1 см3 ацетонитрила. После проведения всех вышеперечисленных процедур образец готов для ВЭЖХ анализа.
В качестве стандартных растворов используют шесть образцов крови с известными концентрациями ивермектина и аба-
138
мектина. Для этого в центрифужных пробирках готовят шесть водных растворов объемом 1 мл, содержащих 3 % Ыа2ЭДТА, 0,9 % NaCl, ивермектин (0, 10, 50, 100, 500, 1000 нг, соответственно) и абамектин 500 нг. pH растворов доводят до 7,4 раствором NaOH. Ивермектин и абамектин добавляют в виде аликвот ацето-нитрильных растворов. Конечное содержание ацетонитрила не должно превышать 0,1 % для предотвращения гемолиза крови.
В пробирки с приготовленными растворами отбирали по 9 мл крови, получая шесть стандартных образцов крови с концентрациями ивермектина 0, 1,5, 10, 50, 100 и абамектина 50 нг/мл. Дальнейшую подготовку проб проводили аналогично образцам крови.
Хроматографический анализ проводили на ВЭЖХ системе «Стайер», состоящей из ВЭЖХ насоса серии 2, флуориметриче-ского детектора модели 121, колонки Luna С 18(2) 5 цш 150x2,0 mm. Подвижная фаза - ацетонитрил: метанол -5:4, скорость потока 300 мкл/мин. Объем инжектируемой пробы 20 мкл. Детектирование вели по интенсивности флуоресценции производных ивермектина и абамектина (компоненты В]а) при длинах волн возбуждения и эмиссии 365 и 470 нм соответственно.
Для получения достоверных результатов проверяют линейность калибровочной кривой, построенной по отношению площадей хроматографических пиков ивермектина и абамектина (компоненты В}а) от концентрации ивермектина.
Строят кривую зависимости коэффициента аппроксимации kf от содержания ивермектина в стандартном образце крови. Для этого kj рассчитывают по формуле
