Справочник по производству спирте. Сырье, технология и технохимконтроль - Яровенко В.Л.
Скачать (прямая ссылка):
гося после действия фермента. Разница между показателями оптических плотностей растворов соответствует количеству гидролизо-ванного крахмала-субстрата.
Обработка результатов. Количество гидролизов энного крахмала С (в г) определяют по формуле C=O1I (Di-D2)IDx, где 0,1 - количество крахмала, взятое для испытания в качестве субстрата, г; D] - оптическая плотность контрольного раствора; D%-оптическая плотность опытного раствора.
Если количество гидролизованного крахмала меньше 0,02 или больше 0,07 г, испытание повторяют, беря для разбавления соответственно большее или меньшее количество основного раствора фермента.
Если в результате ферментативной реакции количество гидролизованного крахмала находится в указанных пределах, полученные данные используют для расчета амилолитической активности.
Амилолитическую активность AC (в ед./г) препаратов бактериального происхождения определяют по формуле AC= (5,885• С+ + 0,001671)-1000:",
препаратов грибного происхождения - по формуле AC = = (7.264С - 0,03766) • 1000 : п,
где С - количество гидролизованного крахмала, г; п - количество ферментного препарата, взятое для испытания, мг; 1000 - коэффициент пересчета в граммы; 5,885; 0,001671; 7,264; 0,03766 - коэффициенты расчетного уравнения, полученные при математической обработке экспериментальных данных зависимости количества гидролизованного крахмала от количества фермента, взятого для испытания (в коэффициенты введен множитель для пересчета на 1 ч действия фермента).
Определение глюкоамилазной активности (ГлА). Определение ведется по ГОСТ 20264,4-74. Метод основан на определении количества глюкозы, образующегося при гидролизе растворимого крахмала ферментом глкжоамилазой.
Глюкоамилазная активность характеризует способность ферментного препарата катализировать расщепление растворимого крахмала до глюкозы и-выражается числом единиц активности в 1 г препарата.
За единицу глюкоамилазной активности принято такое количество ферментов, которое, действуя на растворимый крахмал при 30° С и заданном значении рН 4,7 в течение 1 мин, освобождает 1 мкмоль глюкозы. Глюкоза определяется глюкозооксидазным методом с применением глкжозооксидазы и пероксидазы.
Фермент глюкозооксидаза катализирует окисление e-D-глюкозы кислородом воздуха до глюконовой кислоты. Вторым продуктом реакции является пероксид водорода. Оба конечных продукта образуются в количествах, эквимолярных окисленной глюкозе. Пероксид водорода под влиянием фермента пероксидазы окисляет гек-сацианоферроат калия, который переходит в гексацианоферриат калия, окрашенный в лимонно-желтый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна количеству глюкозы. Порядок определения активности и всех связанных с этим работ следующий.
Приготовление 1%-ного раствора крахмала (субстрат) и ацетатного буфера с рН 4,7 - как и при определении АС. Приготовление 1 M фосфатного буферного раствора с рН 7,5. Фосфатный буферный рас
твор с рН 7,5 готовят смешиванием равных объемов растворов Л (136 г безводного гидроортофосфата калия по ГОСТ 4198-75 растворяют в мерной колбе вместимостью 1000 мл, объем доводят до метки дистиллированной водой) и Б (56 г гидроксида калия растворяют в мерной колбе вместимостью 1000 мл, объем доводят до метки дистиллированной водой).
Приготовление 0,1% -ного раствора гексациа-ноферроата калия (раствор А). 0,1 г гексацианоферроата калия по ГОСТ 4207-75 растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл. Раствор готовят непосредственно перед определением.
Приготовление раствора глюкозооксидази (раствор Б). 5-6 мг глюкозооксидази, соответствующих 500- 600 ед./г ферментативной активности (при активности глюкозоок-сидазы 100000 ед./г), растворяют в 1 M фосфатном буферном растворе с рН 7,5 в мерной колбе вместимостью 50 мл и затем добавляют 2 мг пероксидазы. Объем доводят до метки 1 M фосфатным буферным раствором.
Приготовление рабочего раствора (раствор С). Рабочий раствор С готовят смешиванием равных объемов растворов А и В. Полученный раствор хранят в темной склянке в холодильнике в течение 2-3 сут.
Приготовление стандартных растворов глюкозы. Для приготовления используют перекристаллизованную из спирта безводную глюкозу, которую хранят в эксикаторе над хлористым кальцием. Для приготовления раствора отвешивают на аналитических весах 100 мг глюкозы с точностью до четвертого знака после запятой и растворяют ее в 100 мл насыщенного раствора бензойной кислоты (для приготовления насыщенного раствора бензойной кислоты 2,7 г бензойной кислоты растворяют дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 1000 мл). Из этого раствора отбирают 5, 10, 15 мл в мерные колбы вместимостью 100 мл и доводят объем до метки бензойной кислотой. Полученные растворы с содержанием 50, 100 и 150 мкг глюкозы в 1 мл используются для построения градуировочной кривой.
Приготовление осиовиого р"а створа ферментного препарата. 0,1 г исследуемого препарата взвешивают на аналитических весах в стаканчике вместимостью 25-30 мл. Навеску тщательно растирают стеклянной палочкой с небольшим количеством воды, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят дистиллированной водой до метки. Раствор фильтруют через бумажный фильтр. Раствор ферментного препарата может храниться в течение 1 сут при температуре от 2 до 6° С.
