Практикум по агрохимии - 2-е изд. - Минеев В.Г.
ISBN 5-211-04265-4
Скачать (прямая ссылка):
Актуальная активность измеряется при конкретных сочетаниях экологических факторов для изучаемой системы и характеризует реальную интенсивность процесса в определенный момент времени.
Потенциальная активность измеряется при оптимуме влажности и температуры и при избытке источника питания, вследствие чего является показателем максимально возможного для данной системы уровня азотфиксации.
Ацетиленовый метод
Нитрогеназа - азотфйксирующий ферментный комплекс диазо-трофных бактерий - способна восстанавливать не только молекулярный азот до аммиака, но и ряд других соединений, имеющих в молекуле тройную связь, в частности ацетилен. Катализируемая нитрогеназой
307
реакция восстановления молекулярного азота описывается следующим уравнением: N2+ 6Н' + бе -> 2NH3 (I)
Наиболее важным преимуществом использования ацетилена в качестве субстрата для нитрогеназы является то, что единственным конечным продуктом реакции является этилен:
C2H2 + 2H+ +2е^> C2H4 (II)
Константа Михаэлиса (Км) для реакции восстановления ацетилена примерно в 10 раз ниже, чем для редукции N2, а растворимость C2H2 почти в 60 раз выше, чем азота (при 200C и 1 атм. в 1 дм3 воды растворяется около 1000 см3 C2H2 и только 15 см3 N2). Вследствие этого при наличии в газовой фазе уже 5% ацетилена восстановление молекулярного азота полностью тормозится и протекает только образование этилена.
Как следует из уравнений реакций I и И, фиксации 1 молекулы азота соответствует образование 3 молекул этилена, и, следовательно, коэффициент пересчета от С2Н2-редукции к ^-фиксации равен 3. Этилен анализируется на газовом хроматографе; при этом чувствительность обнаружения нитрогеназы составляет 10~12 М, что более чем в 106 выше по сравнению с методом Кьельдаля и в 103 выше изотопного (15N) метода.
Особенности ацетиленового метода
Инкубация с ацетиленом предполагает в качестве обязательного условия быстрое и равномерное перемешивание газов в исследуемой системе. Последней может быть образец почвы нарушенного или естественного (монолит) сложения, участок почвы известной площади, вегетационный сосуд с растениями и пр. Благодаря хорошей растворимости ацетилена в воде это условие хорошо выполняется для водных и песчаных культур растений, для почв легкого механического состава. Более сложно протекает газообмен в почвах тяжелого механического состава и в переувлажненных почвах, что приводит к недооценке реальной интенсивности азотфиксации. Одним из способов усиления газообмена является принудительная подача ацетилена в толщу почвы.
Длительность инкубации с ацетиленом оказывает значительное влияние на результаты определения азотфиксации. Так, при длительной (более 2 ч) инкубации наблюдаются значительные отклонения коэффициента пересчета от теоретического. Произвольное увеличение времени инкубации в атмосфере ацетилена - наиболее распространенная ошибка при использовании ацетиленового метода. Чаще всего прибегают к этому в попытке повысить чувствительность обнаружения этилена, особенно при низкой интенсивности азотфиксации. Нередко образцы инкубируют в течение 12 - 24 ч и более. Другой причиной увеличения времени инкубации является желание проводить измерения этиленогенеза в области линейного возрастания ацетиленредукции, наблюдающейся после своеобразной лаг-фазы длительностью 6 - 24 ч, в течение которой про
308
исходит «перестройка» популяций азотфиксирующих бактерий, формируется новое их сообщество, не характерное для исходного образца.
Длительная инкубация с ацетиленом оказывает и ряд других воздействий на азотфиксирующую систему. Это проявляется в форме вторичной реакции растений и микроорганизмов на изменение температуры и повышение концентрации CO2 в замкнутом объеме инкубационной камеры (парниковый эффект). Наиболее значимо это при изучении азотфиксации в системе почва - растение, в которой при длительной инкубации создаются условия, способствующие усилению микробной активности. Стимуляция их происходит как из-за патологической реакции растений и микроорганизмов на присутствие ацетилена и этилена, так и в результате активизации фотосинтеза.
Следовательно, первым общим правилом при использовании ацетиленового метода является сведение к минимуму времени инкубации азотфиксирующих систем в атмосфере ацетилена: в зависимости от конкретных задач исследования время инкубации может составлять от 15-30 мин до 1 - 1,5 ч и не должно превышать 2 ч. Второе условие -контроль за неспецифическим образованием этилена. Этилен образуется многими почвенными грибами и бактериями, выделяется корнями растений, постоянно присутствует в техническом ацетилене. Он нередко обнаруживается в воздухе лабораторных помещений, где источниками его являются пламя газовых горелок и спиртовок, а также разрушающиеся на свету или при нагревании резина и полиэтилен.
В почве интенсивность неспецифического этиленогенеза зависит от ее свойств: почвы, богатые органическим веществом, выделяют этилен в наибольших количествах. Повышенному образованию этилена способствует избыточное увлажнение. Напротив, азотные удобрения, соединения железа и марганца тормозят этиленообразование в почве.
