Химия привитых поверхностных соединений - Лисичкин Г.В.
ISBN 5-9221-0342-3
Скачать (прямая ссылка):
552
Гетероповерхностные сорбенты и их применение
[Гл. 9
п см. далее) при адсорбции только на внешней поверхности частиц. Очевидно, что снижению межмолекулярного отталкивания способствует проведение сорбции вблизи изоэлектрической точки. Как и в случае с любыми полиэлектролитами, эффективное поле макромолекулы можно уменьшить, экранируя заряженные группы противоионами в растворах солей. Однако приводимое авторами значение в -С <«С 0,5 должно относиться к широкопористому силикагелю со значительно большей доступностью внутренней поверхности для белков. К сожалению, авторы не приводят подробностей эксперимента, касающихся ионной силы растворов и параметров используемого для сорбции силикагеля. Измерения величин сорбции проводились спектрофотометрически по поглощению остающегося в растворе белка.
Из приведенных экспериментальных данных следует, что достигнуть плотного белкового покрытия на силикагеле довольно легко. Тем более это должно относиться к поверхностям с развитой структурой на молекулярном и надмолекулярном уровнях, как в случае аморфного силикагеля, модифицированного полярными функциональными группами на углеводородной «ножке».
Более того, как видно из числовых характеристик, макромолекулы при адсорбции, по-видимому, претерпевают некоторые специфические изменения, обусловливающие дальнейшую сравнительно прочную многослойную сорбцию.
Таким образом, при создании на поверхности модифицированного силикагеля белкового покрытия контролируемой толщины требуется снижение адсорбционной активности альбумина, что может быть достигнуто повышением ионной силы раствора или снижением концентрации белка. В первом случае высокая концентрация противоионов улучшает экранирование полярных групп белка и на поверхности силикагеля, тем самым уменьшая прочность контактов белок-белок и белок-поверхность, поэтому для повышения прочности и однородности образующегося покрытия второй вариант, на наш взгляд, более предпочтителен.
Исходя из того, что в плазме крови содержится в общей сложности около 7 % белков, и, по многочисленным литературным данным, такая концентрация обеспечивает сверхплотное покрытие, в работе [99] использовали белковые растворы с концентрациями, не превышающими физиологические. Низкая концентрация белка к тому же понижает вероятность связывания макромолекул в объеме и присоединения надмолекулярных агрегатов к белковой поверхности сорбента в процессе фиксации белка, что может нарушать однородность покрытия.
Действительно, если применять для модифицирования белковые растворы в диапазоне 1-7 %, то удается получить сорбенты с различным количеством иммобилизованного белка, что было подтверждено различными независимыми методами, включая хроматографические.
Для растворения белка в области концентраций, необходимых для синтеза, достаточно использовать чистую воду. Однако скорость растворения существенно увеличивается уже при небольших добавках неорганических солей. Поэтому сначала требуемое количество белка растворяли в небольшом количестве натрий-фосфатного буферного раствора, после чего раствор доводили до требуемого объема с концентрацией 3 мМ. При модифицировании плазмой крови никакие соли не добавляли.
Заманчива непосредственная сорбция белков на силикагеле (чистом или модифицированном) без предварительной активации в подходящих условиях с последующей обработкой бифункциональным сшивающим агентом для образования сплошной псевдополимерной обшивки, состоящей из скрепленных между собой белковых глобул. При этом, однако, следует учитывать, что, по данным В. Н. Из-
9.9]
Сорбенты с иммобилизованными белками
553
майловой и П. А. Ребиндера [92, с. 82-89], вблизи изоэлектрической точки (при pH = = 4,9 -г 5,0) при низких концентрациях белка адсорбция из раствора на твердых поверхностях невысока, и время достижения максимальной адсорбции достигает нескольких часов.
Первые попытки достижения воспроизводимости анализов биологических жидкостей при прямом вводе пробы связаны именно с непосредственной белковой сорбцией на сорбенте. Так, еще в 1982 г. X. Йошида с сотр. предложили вариант обработки колонок, заполненных обращенно-фазовым сорбентом Cje (20-30 мкм, dp = 12 нм), путем пропускания раствора БСА или плазмы кролика в метаноле при pH = 3. После повторной промывки метанолом для удаления денатурированного неадсорбированного белка колонку использовали для анализа плазмы крови [102, 103]. Однако такая обработка колонок приводила к существенному снижению эффективности разделения, особенно при применении метода к мелкозернистым (5 мкм) сорбентам. Наряду с этим время жизни таких колонок было сравнительно коротким, что неудивительно, поскольку динамическое модифицирование белком проводили в неравновесных условиях, а денатурированный и химически незакрепленный белок удерживался только адсорбционными силами. Поэтому в более поздних разработках эти авторы использовали колонки, приготовленные таким образом лишь для предварительного концентрирования в системах с переключением колонок при анализе плазмы крови с прямым вводом [104, 105]. Дальнейшая работа этой группы [49] связана, в основном, с иммобилизацией авидина и овомукоидов на активированных ХМК и применением последних в сложных автоматизированных системах для анализа биологических жидкостей.
