Химия привитых поверхностных соединений - Лисичкин Г.В.
ISBN 5-9221-0342-3
Скачать (прямая ссылка):
/, нм
Рис. 9.11. Влияние pH на размеры конфигурации молекул бычьего сывороточного альбумина в 0,15 М NaCl. а и Ь — оси эквивалентного эллипсоида вращения [52]. Данные получены методом измерения поступательной диффузии и характеристической вязкости
9.9]
Сорбенты с иммобилизованными белками
549
белка со всех сторон с неполярным окружением бимолекулярного липидного слоя, у глобулярных белков гидрофобные и гидрофильные участки представлены примерно поровну, и их распределение имеет более сложный характер. Значения коэффициентов молекулярной шероховатости белков зависят от метода расчета и лежат в пределах 1,7-3,0 [91, с. 25]. Очевидно, что распределение полярных и неполярных участков и топография молекулярной поверхности белков должны существенно влиять на их сорбцию на поверхности чистого и модифицированного силикагеля.
Наконец, следует рассмотреть возможность и существующие методы иммобилизации альбумина на различных поверхностях. Универсальным методом является, безусловно, прививка молекул на заранее активированную поверхность. Так, например, в [96] приводится методика, согласно которой после активации глутаровым альдегидом гидратированных полиакриламидных шариков их прибавляют к присоединяемому белку (~ 1—5 мг белка в 1 мл раствора на 1 мл шариков) в 10 мМ фосфатном буферном растворе (pH = 7,4), содержащем 150 мМ NaCl, и перемешивают при комнатной (или при необходимости 4°С) температуре в течение ночи. Сходным образом, используя глутаровый альдегид в присутствии NaBHaCN для иммобилизации альбумина, активировали 7-аминопропилсиликагель. На полученном сорбенте разделяли растворимые фенолы [97]. Ранее, при рассмотрении иммобилизации овомукоидов, была показана возможность предварительной активации аминопропилсиликагеля 1Ч,Г*»т-дисукцинимидилкарбонатом.
Здесь важно заметить, что прочность таких покрытий, равно как и сохраняемость во времени конформации глобул, можно повысить дополнительной внутри-и межмолекулярной сшивкой. Как упоминалось, это довольно распространенный прием. Благодаря своей бифункциональности и высокой реакционной способности, одним из универсальных и наиболее распространенных реагентов для этой цели является глутаровый альдегид, традиционно применяющийся в белковой химии (например, как фиксирующее вещество в электронной микроскопии [53]). Более подробно свойства глутарового альдегида рассмотрены ниже.
Глутаровый альдегид позволяет эффективно осуществлять внутри- и межмо-лекулярную сшивку белковых макромолекул, образуя шиффовы основания со свободными аминогруппами основных аминокислот, входящих в состав белка (таких как аргинин, лизин или гистидин). Коммерческий глутаровый альдегид (25%-й водный раствор) содержит лишь около 3% мономера (I) и продукты обратимой полимеризации, как показано на рис. 9.12. Шиффовы основания, образуемые в кислой среде (II и III) при pH = 3, неустойчивы к кислотному гидролизу, а в
а
I IV
Рис. 9.12. Продукты обратимой полимеризации глутарового альдегида (I) в водном растворе в кислой (а) и щелочной (б) среде
550
Гетероповерхностные сорбенты и их применение
[ Гл. 9
нейтральных и слабощелочных средах (когда реагент обычно используется для модифицирования белков) образуется полимер IV, где п растет с увеличением pH до образования осадка. При pH ~ 7 полимер IV образует устойчивые к кислотному гидролизу шиффовы основания с участием сопряженных внутренних альдегидных групп (связи, образованные концевыми группами, неустойчивы).
Следует учитывать, что из-за вариабельности п число сшивок определить трудно, однако можно надеяться, что при достаточной длительности реакции число затронутых свободных аминогрупп будет приближаться к максимально возможному (для БСА — около 70 на молекулу). Причем для эффективной сшивки концентрацию глутарового альдегида необходимо подбирать таким образом, чтобы количество функциональных (альдегидных) групп реагента не превышало количества реакционноспособных функциональных (аминогрупп) в закрепляемом белке. По причине невозможности точного определения п и неизвестной доступности аминогрупп и расстояний между ними в белковой макромолекуле это соотношение нужно подбирать эмпирически.
Предполагая, что в процессе приготовления и хранения белкового раствора, а также при модифицировании им сорбента существует опасность заражения бактериями и разложения белка, что может привести к невоспроизводимости результатов, поставили следующий оценочный опыт. В свежеприготовленный отфильтрованный 5 %-й белковый раствор в 0,05 М фосфатном буферном растворе (pH = 7) был добавлен глутаровый альдегид из расчета 10 молекул (в пересчете на мономер) на одну макромолекулу белка, и после перемешивания в течение часа полученный и контрольный (без добавления альдегида) растворы были оставлены в открытом стакане на свету при температуре около 20 °С. Через двое суток в контрольном растворе были отмечены явные признаки разложения: помутнение, появление пузырьков и характерного запаха, в то время как в растворе с глутаровым альдегидом эта признаки были едва заметны лишь на четвертые сутки.
