Химия привитых поверхностных соединений - Лисичкин Г.В.
ISBN 5-9221-0342-3
Скачать (прямая ссылка):
Защита внешней поверхности от адсорбции белковых макромолекул была использована и в случае синтеза сорбентов на основе частиц, имеющих на внешней поверхности бромпропильные привитые группы. В последнем случае глобулы альбумина, имеющие концевые аминогруппы, при ультразвуковой обработке химически прививаются непосредственно к поверхности частиц.
В качестве матриц для синтеза гетероповерхностных ионообменных сорбентов [13, 20] использовали модифицированные силикагели с удельной поверхностью примерно 250 м2/г марок Диасорб-130-Сульфо (размер частиц 10 мкм), Диасорб-
130-ДЕАЕ (5 мкм), Диасорб-130-Карбокси (5-6 мкм) и Диасорб-130-ИДК (6-7 мкм) (все силикагели предоставлены ЗАО «БиоХимМак СТ», Москва) с ковалентно закрепленными группами следующей структуры соответственно:
H=Si—О—Si—СН2—СН2—СН2—О—СН2—СН(ОН)—СН2—S03H,
-=Si—О—Si—СН2—СН2^-СН2—О—СН2—СН(ОН)—СН2—N(C2H5)2,
-=Si—О—Si—СН2—СН2—СН2—О—СН2—СН(ОН)—СН2—СООН и -=Si—О—Si—СН2—СН2—СН2—О—СН2—СН(ОН)—СН2—N(C2H4COOH)2.
9.9.2. Иммобилизованные овомукоиды. Мукоиды, впервые обнаруженные в синовиальной суставной жидкости и стекловидном теле глаза, были выделены в отдельную группу по общему признаку: все они представляют собой ковалентно связанные белково-углеводные комплексы (по некоторым версиям термина — еще и не осаждающиеся из подкисленного раствора). Гликопротеид, выделенный из белка куриных яиц, называется овомукоидом. Он не коагулирует при нагревании и поэтому может быть сравнительно легко отделен от других белков. После удаления денатурированных яичного альбумина и яичного глобулина овомукоид осаждают из фильтрата этанолом. Овомукоид содержит около 20 % углеводов; его N-концевой аминокислотой является аланин, а С-концевой — фенилаланин. В состав углеводного компонента входят остатки N-ацетилглюкозамина, маннозы и галактозы в соотношении 7:3:1 [38, с. 296].
Идея использования силикагеля, модифицированного овомукоидом, для анализа биологических матриц с прямым вводом пробы принадлежит авторам работы [47]. Около десятка их более ранних работ описывают возможности применения
9.9]
Сорбенты с иммобилизованными белками
545
таких сорбентов для разделения энантиомеров различных лекарственных препаратов и некоторых природных физиологически активных веществ в модельных смесях либо в биологических жидкостях после специальной пробоподготовки (экстракция, предколонка и др.). В этих работах также обсуждено влияние pH, ионной силы элюента и количества органических добавок на селективность и удерживание энантиомеров [48], нюансы при варьировании условий синтеза (в том числе варианты применения различных сшивающих агентов и дополнительных модификаторов [49, 50]). Вместе с тем, уже в работе [41] сообщается о применении такого модифицированного силикагеля для определения лекарственных энантиомеров в сыворотке крови. Для приготовления сорбента использовали коммерческий аминопропилсиликагель (Ultron-NH2, 5 мкм, 120 A; Shinwa Chemical Industries, Kyoto, Japan), который после активации 1^,1Ч-дисукцинимидилкарбонатом суспендировали в 20 мМ фосфатном буферном растворе (pH = 6,6), к которому добавляли раствор овомукоида. После перемешивания в течение 20 ч при 30° С смесь фильтровали, сорбент промывали водой и метанолом, затем высушивали над Р2О5 и под вакуумом при 40° С, после чего им заполняли колонку суспензионным способом (10 см х 4,6 мм). На полученной колонке анализировали сыворотку крови. При элюировании 50 мМ фосфатным буферным раствором с добавкой метанола (17:3) выход белков крови составлял > 93,8% при значениях pH 3, 4, 6 и 7.
В следующей работе [51] обсуждаются зависимости хроматографических характеристик от длины аминоалкильной «ножки» и физических параметров исходных сорбентов. Так, выяснено, что энантиоселективность растет с увеличением диаметра пор, в то время как для разрешения установлена очевидная обратная зависимость. С изменением длины алкильной ножки хиральное разрешение падает в ряду аминопропил-, аминобутил-, ]М-(4-аминобутил-)-3-аминопропил- и N-(6-аминогексил)-3-аминопропилсиликагель.
Есть и другие примеры синтеза и применения кремнеземов, модифицированных овомукоидами. Так, авторы работы [52] после активации аминогрупп N,N-дисукцинимидилкарбонатом прививали овомукоид на сорбент Unisil Q NH2. Показана хорошая энантиоселективность для разделения изомеров дибензоил-лизина, хлорфенирамина и хлорпреналина при элюировании калий-фосфатным буферным раствором в диапазоне pH = 5,5 6,1. В работе [53] тех же авторов сообщается о сравнении параметров разделения ранее описанного сорбента с аналогичным на основе другого коммерческого аминопропилсиликагеля LiChrosorb-NHj. Авторы отмечают, что у второго сорбента во всех случаях удерживание выше. Для общего снижения времен удерживания кислых препаратов в элюент вводили добавки октил сульфата натрия, и для основных — гидросульфат тетраметил аммония (по 5 мМ). Что касается использования таких сорбентов для анализа биологических матриц при прямом вводе пробы, то, кроме уже упомянутого примера [44], в литературе есть еще работа [54], в которой авторы использовали автоматизированную систему с переключением потоков, состоящую из колонки с иммобилизованным авидином и двух колонок с овомукоидом для определения лекарств в плазме крови.
