Химия привитых поверхностных соединений - Лисичкин Г.В.
ISBN 5-9221-0342-3
Скачать (прямая ссылка):
Каталитическая активность самого альбумина пока мало изучена, однако известно, что в его водном растворе в мягких условиях (pH = 7, при комнатной температуре) происходит метилирование полиядерных фенолов метилиодидом, в то время как в отсутствие белка реакции не наблюдается [39]. В работе [40] показана каталитическая роль альбумина при гидролизе n-нитрофенилацилатов, причем наибольший эффект достигается при длине ацилыюго радикала 8-12 атомов углерода. Реакция ингибируется в присутствии ПАВ типа Твин (Tween-20) и слабее — жирными кислотами (в ряду С4—Сю). В этих фактах нетрудно заметить сродство альбумина к жирным кислотам, о чем будет упоминаться в дальнейшем. Селективность альбумина к ионам переходных металлов подтверждается результатами работы [41], показывающими снижение токсического эффекта меди и ртути (но не кадмия) на изолированные клетки печени крыс в присутствии альбумина.
9.9]
Сорбенты с иммобилизованными белками
543
Из этого следует, что после равномерной адсорбции белковый слой необходимо обрабатывать сшивающим агентом не только для упрочнения и уплотнения защитного покрытия, но и для максимального изменения его нативной структуры так, чтобы внешняя поверхность представляла собой плотную гидрофильную полимерную сетку, по возможности полностью лишенную какой-либо ферментативной активности. Благодаря своему составу (в основном L-аминокислотному), иммобилизованные белки обладают некоторой энантиоселективностыо, что может успешно использоваться для разделения оптических изомеров. В частности, в работе [42] и обзорах [43, 44] подробно обсуждаются возможности хирального разделения на неподвижных фазах, модифицированных гликопротеином, бычьим сывороточным альбумином, сывороточным альбумином человека, овомукоидами, трипсином и химотрипсином.
В этом плане интересно также замечание, сделанное авторами [45]: при разделении большого набора стереоизомеров лекарственных препаратов на колонках с овомукоидом при варьировании pH (5 -ь 7,5) и состава (различные органические добавки) элюента (10 мМ фосфатного буферного раствора) было показано, что энантиоселективность такого сорбента существенно зависит от конформационных изменений в белковых молекулах в изучаемом диапазоне температуры 10 Ч- 35° С, причем селективность к хиральным изомерам кислотных веществ падает с ростом температуры, а для основных наблюдается прохождение через максимум. Этот эффект указывает на существенную зависимость pH от температуры, из чего авторы делают вывод о необходимости тщательного контроля за условиями разделения при использовании колонок с иммобилизованным белком. Здесь также уместно напомнить, что возможность конформационных изменений может быть в значительной степени подавлена плотной поперечной внутри- и межмолекулярной сшивкой белков после их иммобилизации на сорбентах.
Немного забегая вперед заметим, что из аналогичных исследований влияния внешних факторов на энантиоселективность иммобилизованного на аминопропил-силикагеле БСА, авторы работы [46], изучавшие ранее разделение DjL-триптофана в диапазоне 0,5 ч- 45 °С при элюировании 50 мМ фосфатным буферным раствором, рекомендуют оптимальное значение температуры 22,7 ± 2,3 °С и указывают, что если при pH = 6,8 разделение практически отсутствует, то при pH = 7,4 данные энантиомеры разделяются почти полностью. В то же время при закреплении белков только на внешней поверхности (при рассмотрении гетероповерхностных сорбентов), их вклад в разделение низкомолекулярных веществ должен быть крайне мал.
Поэтому в работах, посвященных получению энантиоселективных сорбентов [39, 40, 42-90] с помощью белков, закрепленных на поверхности носителя, должны использоваться достаточно широкопористые кремнеземы или другие пористые носители, чтобы белок занимал по возможности всю поверхность, в том числе и внутри пор. Однако в этом случае теряется смысл создания гетероповерхностных сорбентов для отделения больших молекул от небольших и разделения последних, в то время, как не проникающие в поры большие молекулы должны выходить из колонки первыми. Основное внимание в этих работах уделено разделению стереоизомеров на иммобилизованных белках или фрагментах белков, а поверхность под слоем белка, доступная только небольшим молекулам (при условии создания плотного покрытия из белков или их фрагментов), не участвует в хроматографическом разделении.
Внешняя поверхность сорбента может быть защищена любыми подходящими микрочастицами, в том числе и глобулами белков. В работах [11, 12] для этой цели использован альбумин, глобулы которого были закреплены на поверхности
J44_Гетероповерхностные сорбенты и их применение_[Гл. 9
заранее модифицированных силикагелей. Закрепление проводили следующим образом: на алкилированных кремнеземных частицах Силасорба С-18 («Лахема», Чехия) сорбировали глобулы человеческого или бычьего сывороточного альбумина (ЧСА или БСА) вблизи их изоэлектрической точки (гидродинамический радиус « 4 нм). При воздействии ультразвука глобулы альбумина плотно адсорбировались на алкильных цепях по всей доступной поверхности, но не проникали в поры, сопоставимые по диаметру с ними или уже них. Сшивка глутаровым альдегидом позволяет зафиксировать глобулярную структуру белка и химически соединить глобулы между собой с образованием проницаемого для низкомолекулярных соединений экрана, предохраняющегого алкильные группы сорбента от контакта с макромолекулами содержащихся в пробе белков. Непрореагировавшие альдегидные группы восстанавливали борогидридом натрия. В некоторых случаях по оставшимся альдегидным группам проводили прививку следующего слоя глобул альбумина, снова сшивали глутаровым альдегидом и только потом восстанавливали альдегидные группы. Таким образом, на поверхности частиц сорбента создавалась «рубашка» из сшитых между собой глобул.
