Химия привитых поверхностных соединений - Лисичкин Г.В.
ISBN 5-9221-0342-3
Скачать (прямая ссылка):
Несмотря на большое количество работ механизм удерживания на хиральных фазах с иммобилизованными белками практически невыяснен. Нередко механизм разделения ассоциируют с аффинной хроматографией. Отмечено, что удерживание и энантиоселективность в значительной степени определяются pH и ионной силой водных буферных растворов, используемых в качестве подвижной фазы, а также добавками изопропанола и ион-парных агентов (органических кислот, аминов). Хроматографическое удерживание разделяемых соединений по-разному зависит от перечисленных факторов даже для соединений близких по химической структуре [298]. Очевидно, третичная структура белковых макромолекул обеспечивает наличие множественных (возможно, для каждого соединения своего) хиральных центров, характеризующихся уникальной совокупностью гидрофобных и ионообменных взаимодействий.
Как правило, иммобилизация белков на поверхности кремнезема проводится методами, широко используемыми для закрепления аминосодержащих лигандов в аффинной хроматографии (см. разд. 7.4), однако для повышения стабильности хиральных фаз данного типа используют поперечную сшивку молекул белков. В работе [299] хиральная фаза была получена простой поперечной сшивкой глутаровым альдегидом молекул БСА, адсорбированных на поверхности силикагеля, при этом особо отмечено, что отсутствие прочной ковалентной связи БСА с поверхностью носителя существенно не изменяет стабильности фазы.
Важным недостатком хиральных неподвижных фаз с привитыми белками является невысокая нагрузочная емкость хроматографических колонок, что свидетельствует о наличии в макромолекуле одного или нескольких центров стереоспеци-фического связывания, соответственно, большая часть иммобилизованного белка является балластом. Вследствие ограниченного количества доступных белковых молекул в последнее время наметились тенденции к направленному изменению
8.2] Применение поверхностно-модифицированных материалов в хроматографии 447
свойств макромолекул путем химической модификации концевых аминокислотных остатков с целью изменения заряда, гидрофобности, стерических факторов; использования биосинтетических аналогов за счет ввода или исключения определенных аминокислот методами генной инженерии; отбора наиболее перспективных фрагментов ферментативного гидролиза белковых молекул; пептидного синтеза [293]. Целью модификации является либо увеличение числа стереоспецифических центров в макромолекуле, либо уменьшение размеров макромолекулы и увеличение поверхностной концентрации привитого лиганда меньшего размера. В обоих случаях достигается увеличение числа стереоспецифических центров в объеме слоя сорбента.
Оригинальный прием хроматографического разделения энантиомеров использован в работе [296]. Ее авторы применили хроматографическую колонку, заполненную силикагелем с привитыми протеазами трипсином и а-химотрипсином, для разделения метиловых эфиров D ,L-аминокисл от. При этом в полной мере реализуется стереоспецифическая способность данных ферментов к расщеплению эфирных связей только в эфирах L-аминокислот. При введении в хроматографическую колонку (авторы называют ее ферментативным реактором) смеси метиловых эфиров D,L-аминокислот происходит количественный ферментативный гидролиз L-формы. Высокая «условная энантиоселективность» разделения для ароматических кислот от 2,5 до 17,6 связана не столько с селективным распознаванием, сколько с заметными различиями в хроматографических свойствах свободной аминокислоты и ее метилового эфира. Другой, не менее эффективной, возможностью создания белковых хиральных фаз может оказаться закрепление на поверхности силикагеля моноклональных антител на определенный хиральный оптически активный субстрат, хотя в этом случае может возникнуть вопрос об универсальности использования таких сорбентов.
Хиральные фазы с привитыми изоструктурными полимерами. Среди сорбентов с привитым полимерным слоем можно выделить две основные группы. В одну из них входят сорбенты с включенными в полимерную цепь хиральными фрагментами. Такая группа создавалась с целью увеличения стабильности хиральной стационарной фазы и снижения отрицательного эффекта силанольных групп силикагеля на качество хроматографического разделения. В этом случае полимерный слой играет роль своеобразной хиральной подложки или промежуточного слоя между силикагелем и закрепленными хиральными молекулами. Другая группа сорбентов с полимерным слоем предусматривала хроматографическое разделение энантиомеров за счет пространственной структуры самого полимера.
Так, в работе [300] поверхность силикагеля обрабатывали продуктом взаимодействия 3-аминопропилтриэтоксисилана с хлорметилированным линейным полистиролом с последующей прививкой L-оксипролина по хлорметильным группам. В этом случае полимерный слой прочно связан с поверхностью силикагеля за счет взаимодействия триэтоксисилильных групп с силанольными, что позволяет эксплуатировать полученную хиральную фазу для разделения D,L-аминокислот в варианте лигандообменной хроматографии в сравнительно жестких условиях: слабокислые (pH = 4,0ч-4,5) водные элюенты, термостатирование хроматографической колонки при температурах до 80° С.
