Курс органической химии - Каррер П.
Скачать (прямая ссылка):
384
Гл. 18. Аминокислоты, пептиды и белки
Для разделения аминокислот, образовавшихся в результате гидролиза полнпептпда, еще Э. Фишер предложил использовать фракционную вакуумную перегонку их эфиров. Этот метод требует сравнительно большого количества вещества. В самое последнее время он, однако, вновь становится очень актуальным, так как газовая хроматография позволяет разделить ничтожные количества смеси эфиров аминокислот. Широкое применение для разделения смесей аминокислот нашла за последние годы бумажная хроматография. Если требуется определить качественный состав смеси аминокислот, то проводят двухмерное хро-матографировапие на листе бумаги и проявляют хроматограмму нингидрином, причем каждая аминокислота дает окрашенное пятно.
Очень удобным оказалось превращение аминокислот при помоцщ 2,4-динитрофторбензола в соответствующие желтые Ы-2,4-динитрофе-нильные производные (ДНФ-производные), которые затем разделяют хроматографией на бумаге и определяют колориметрически (Ли, Леви).
Отдельные аминокислоты можно качественно и количественно определять микробиологическим способом. Для роста мутантов Ыеигозрога сгаББа и других микроорганизмов часто требуется присутствие определенных аминокислот. Если в питательную среду, содержащую все необходимые аминокислоты кроме одной, внести подходящий микроорганизм, то его размножение будет происходить только в том случае, если к среде будет добавлена недостающая аминокислота. При этом размножение будет пропорционально количеству добавленной аминокислоты (до некоторой оптимальной концентрации) .
Одним из наиболее точных методов микроопределения аминокислот является их разделение на ионнообменных смолах при различных температурах и рН (Штейн и Мур).
Определение концевых групп. Особое значение для выяснения строения пептидов имеет определение аминокислот, расположенных на концах полипептидной цепи. Если у какого-нибудь пептида или белка найдена одна единственная аминокислота в качестве Ы- или С-концевой группы, то с очень большой вероятностью можно считать его однородным соединением.
Для определения концевых групп применяются следующие методы:
а) ДНФ-метод (Сейнджер). Обработка пептида или белка 2,4-динитрофторбензолом приводит к арнлирозанпю я-аминогруппы К-концевой аминокислоты (а также арнлированию амино- и оксигрупп боковых цепей лизина, тирозина и т. п.). После полного гидролиза желтые а-ДНФ-аминокислоты о, п- (021\,)2СбНзК1НСН (И)СООН отделяются от других продуктов реакции и идентифицируются.
б) Финилтиогидантоиновый метод (Эдмап). При действии фенилизотиоцианата (фенилгорчичного масла) на свободные аминогруппы пептидов и белков образуются соответствующие производные тиомочевины. Обработка их соляной кислотой приводит к отщеплению К-концевой аминокислоты в виде 2-феннламинотиазолинонового производного, легко изомеризугощегося в фенилтиогидаптоин, который может быть выделен и идентифицирован. Остаток молекулы пептида или белка может быть снова подвергнут тем же превращениям, в результате чего отщепляется в виде фенилтиогидантоина следующая аминокислота. Так как реакция протекает почти количественно, этим способом удается отщепить один за другим до 10 остатков аминокислот и определить тем самым их последовательность. Френкель-Конрат и Леопис разработали микроаналитическое видоизменение этого метода,
Синтез полипептидов 385
для которого необходимо всего 0,1-0,2 микромоля пептида: С6Н3—Х=С=5-{-НЛ'СНкСО—ын ...—»¦
II
-> С8Н5—Х'Н—С-ХНСНкСО—ХН • . .
к—сн—со
I I
НХ Б
кнсн.
и—сн—со
I I
Н2Х . . . —> НХ X—С6НВ \5/
фенилтиогидаптоин
в) Расщепление гидразином (Акабори). Обработка пептидов или белков гидразином при 100° в течение 3—10 часов приводит к расщеплению всех пептидных связей. При этом все аминокислоты, кроме С-концевых, превращаются в соответствующие гидразиды аминокислот, которые с бензальдегидом образуют гидразоны, растворимые в органических растворителях. Это используется для отделения их от С-концевых аминокислот, остающихся неизмененными. Последние затем идентифицируют обычными методами:
Н [КНСН1*СО]„—ХНСИИСООН -м^'"'> /гН,,ХСНкСОХНХН,+ Н?ХтСНкСООН
г) Расщепление к а р б о к с и п е п т и д а з о й и аминп-п е п т и д а з о и. Карбоксипептндаза поджелудочной железы отщепляет от пептидов и белков одну за другой С-концевые /.-аминокислоты. Освободившиеся С-концевые аминокислоты могут быть определены качественно; если же контролировать реакцию количественно, то в благоприятных условиях удается определить последовательность 2—5 аминокислот. Не отщепляются глицин, лизин, пролин; очень быстро отщепляются ароматические аминокислоты и лейцин. Аналогично действует аминопептидаза, которая ступенчато расщепляет пептиды с аминного конца.
Синтез полипептидоз. Для того чтобы связать аминокислоты в строго определенной последовательности, нужны защитные группы, которые предотвратили бы нежелательные конденсации между карбоксильными и аминными группами. Необходимо, чтобы такие группировки могли быть впоследствии избирательно отщеплены без затрагивания пептидных связей.
