Жидкостная хроматография при высоких давлениях - Энгельгардт Х.
Скачать (прямая ссылка):
Экранировать силанольные группы можно даже группами с 3-4 атомами углерода, но получить более высокие значения к' и относительно большее удерживание удается, только вводя более длинные алкильные группы (предпочтительно С18).
Предельная допустимая нагрузка фазы с группами С18 (~ 20% связанного углерода) примерно вдвое больше, чем нагрузка фазы с группами С4 (~ 7% связанного углерода). По сравнению с голым силикагелем предельно допустимая нагрузка обращенной фазы
128
Глава VI
с группами С18 примерно на порядок выше и составляет около 2-10'3 г пробы/г неподвижной фазы.
Разделительная способность колонок, заполненных обращенной фазой, соответствует колонкам, заполненным силикагелем, при условии, что размер частиц и коэффициенты диффузии идентичны. Все же часто значения h для удерживаемых веществ на ОФ больше, чем ожидается, особенно если элюентом служит вода, не содержащая добавок.
В. Влияние растворителя на разделение
Если элюирование ведется водой, на обращенных фазах наибольшее удерживание показывают органические вещества. Элюирование пробы можно ускорить, увеличивая концентрацию органического растворителя в воде, следовательно, величина удерживания уменьшается с уменьшением полярности элюента. На рис. VI. 10 показана зависимость значений к' фенола и бутанола от содержания метанола (0-100%) в воде, используемой в качестве элюента на двух различных ОФ (С4 и С18). Наклон кривых, по-видимому, не зависит от числа алкильных групп. При концентрации воды свыше 20% получают линейную зависимость lg к' от концентрации [30]. (При более высоких концентрациях метанола используемые здесь пробы почти инертны.) Линейная зависимость lgfc' от концентрации метанола в воде наблюдается и для других систем [31]. Кроме того, из приведенных на рис. VI, 10 кривых можно видеть, что получить идентичные времена удерживания на обращенных фазах С4 и С18, т. е. скомпен-
Рис. VI.10. Зависимость значений к' от состава элюента.
Неподвижные неполярные фазы: бутил (С*) и октадецил (С1в); элюеит: вода — метанол. Проба: 1 — феиол; 2 — н-бутанол.
Адсорбционная хроматография
129
Таблица VI.3 Элюотропный ряд для обращенной фазы
Элюент Относительное удерживание на ОФ
с, ^18
Метанол 1,0 1,0
Ацетонитрил 3,2 3,1
Этанол 3,2 3,1
Изопропанол 8,4 8,3
Диметилформамид 9,4 7,6
н-Пропанол 10,8 10,1
Диоксан 12,5 11,7
сировать увеличение значений к' на обращенной фазе С18, вызванное удлинением алкильной цепи от С4 до С18, можно, повысив концентрацию метанола в элюенте.
Вязкость водно-метанольных смесей проходит через максимум (1,84 сП) при 20°С, когда концентрация метанола в воде составляет 40%; при этой же температуре вязкость метанола равна 0,6 сП, а вязкость воды — 1,0 сП. Поскольку эта смесь относится к числу неидеальных, высота, эквивалентная теоретической тарелке, h зависит от состава элюента. Все другие смешивающиеся с водой органические растворители отличаются большей, чем у метанола, элюирующей силой. Чем сильнее растворитель удерживается из воды на обращенной фазе, тем больше элюирующая сила этого растворителя или его смеси с водой.
В табл. VI.3 приведены величины удерживания (относительно метанола) важнейших не поглощающих в УФ-области смешивающихся с водой органических растворителей на обращенных фазах С8 и С18. Этот порядок соответствует обращению элюотропного ряда для адсорбционной хроматографии (см. табл. VI.2). Наиболее сильным элюент ом для системы с ОФ, полностью вымывающим все компоненты пробы, следует считать тот органический растворитель, из которого адсорбция на силикагеле является наибольшей. Следовательно, наиболее сильные элюенты в системе с ОФ — алифатические углеводороды. Если, например, элюирование ведется смесями этанол - вода и изопропанол - вода равной концентрации, то последняя смесь быстрее вымывает пробу из колонки. На смеси двух элюентов распространяется то же эмпирическое правило, которое было установлено для адсорбционной хроматографии на полярных неподвижных фазах: лучше использовать более высокие концентрации слабее элюирующего растворителя, чем небольшие концентрации (несколько процентов) сильного элюента. Приготавливать такую смесь следует очень тщательно, так как нежелательный эффект вы-
9 Заказ 825
130
Глава VI
теснения может вызвать элюирование нескольких веществ в одном пике. Линейная зависимость lg к' от концентрации органического компонента в воде уже в системе вода — ацетонитрил отсутствует [31]. В системах с ОФ добавление уксусной кислоты к элюентам вызывает такое же уменьшение элюирования, как и добавление метанола. Поэтому, например, при разделении кислот элюирующую силу .смеси растворителей можно менять, добавляя уксусную кислоту.
Химически связанные фазы имеют большое преимущество по сравнению с голыми силикагелями: кондиционирование колонок с ОФ при смене растворителя проводится очень быстро. Во многих случаях для того, чтобы разделительная колонка опять пришла в состояние равновесия, достаточно прокачать через нее в среднем 10 колоночных объемов нового элюента.
Однако в системах с ОФ довольно трудно точно определить мертвое время, особенно если элюентом служит вода. В качестве детектора при точном определении мертвого времени необходим дифференциальный рефрактометр; в качестве неудерживающейся пробы можно использовать окись дейтерия D20. Если элюирование ведется водно-метанольными смесями, инертным веществом может быть вода или метанол. Если в распоряжении хроматографиста имеется только УФ-детектор, подобрать инертное вещество, поглощающее в УФ-области, сложно. Многие вещества либо удерживаются, либо, если они диссоциируют, могут исключаться. Исключение, по-видимому, вызывается теми же причинами, что и доннановский потенциал в ионообменной хроматографии [32, 33]. Этот эффект можно подавить путем добавления нейтральных солей (0,1 —0,3 моль/л) к элюенту.
