Жидкостная хроматография при высоких давлениях - Энгельгардт Х.
Скачать (прямая ссылка):
5. Характеристика и испытание разделительных колонок
Как показано в разд. II.E, минимальная достижимая высота, эквивалентная теоретической тарелке, является функцией размера частиц неподвижной фазы. Чем меньше диаметр частиц, тем меньше высота тарелки и тем больше при одинаковой длине разделительной колон-
4*
52
Глава III
ки число тарелок. Конечно, это справедливо при условии, что все колонки заполнены одинаково хорошо. Чем меньше диаметр частиц, тем большие требования предъявляются к аппаратуре, особенно если диаметр частиц меньше 10 мкм. При этом размывание полосы вне колонки может стать настолько большим, что h перестанет зависеть от диаметра частиц. Определение внеколоночного размывания (например, в узле ввода пробы, детекторе и подводящих коммуникациях) возможно только при больших затратах (например, требуются безынерционные самописцы и т. д.). Подобные теоретические соображения, например относительно реального размывания полосы в разделительной колонке, мало что дают практику. Ему необходимо приготовить колонку с определенным числом тарелок, для того чтобы можно было выполнить необходимое разделение, и важно установить, можно ли считать оптимальным разделение, проведенное на такой колонке с использованием имеющейся у экспериментатора аппаратуры.
Качество упаковки колонки или минимальное достижимое размывание полосы можно установить из хроматографических данных с помощью следующих опытов [23].
а) Асимметрия пика, особенно инертного и слабоудерживаемых пиков (к' < 5), говорит о плохом заполнении разделительной колонки. Разумеется, предварительно следует устранить нарушения, вызываемые аппаратурой. Если пик инертного вещества и пики со значениями к! < 1 асимметричны, то причиной, возможно, является аппаратура. Это можно установить точно, только сняв кривую h = =f(u). Если при линейных скоростях более 3 мм/с наблюдается отклонение от прямой линии, то скорее всего асимметрия пика вызвана несовершенством прибора. Асимметричность определяют как частное от деления отрезков (w, см. рис. II.1), отсекаемых на нулевой линии перпендикуляром, опущенным из максимума пика на нулевую линию, причем берут отношение отрезка после перпендикуляра к отрезку до перпендикуляра. Если фактор асимметрии больше чем 1,5 (квадрат фактора асимметрии может достигать 2,0 [22]), то колонку следует заполнить заново, так как размывание, или образование хвостов, ухудшает разделение или вызывает загрязнение разделяемых соединений из-за перекрывания их зон, если проводится ми-кропрепаративное разделение.
б) Время удерживания инертного пика (t0) и линейная скорость элюента также относятся к числу основных характеристик разделительной колонки.
В жидкостной хроматографии при высоких давлениях часто трудно решить, удерживается ли анализируемое вещество, особенно если экспериментатор располагает только УФ-детектором. Если роль элюента выполняет алифатический углеводород (например, н-гептан), то можно в качестве инертного вещества рассматривать тетрахлор-этилен или четыреххлористый углерод. Если в распоряжении имеется
Аппаратура для жидкостной хроматографии
53
дифференциальный рефрактометр, то мертвое время можно точно определить, используя гомолог элюента с меньшей молекулярной массой. Если элюентом служит хлористый метилен, бензол не удерживается. Само собой разумеется, что в этом случае н-гептан — также инертное соединение.
Определить мертвое время для химически связанных неподвижных фаз и воды или смесей воды с органическими растворителями значительно сложнее. Если элюирование проводится смесью с водой, то в качестве инертною соединения можно рассматривать или органический компонент, или воду (дифференциальный рефрактометр!). Тяжелая вода также не удерживается насадкой, если в качестве элюента используют воду. Проблемы возникают также при анализе солей или диссоциированных веществ. Последние могут при прочих равных условиях элюироваться даже перед инертным пиком в результате эффекта исключения (например, в результате наличия доннановского потенциала). В таких случаях мертвое время [0 можно точно определить, только применяя неполярные элюенты и неудерживающиеся пробы.
Проверить результаты измерений можно с хорошим приближением, рассчитав мертвое время по формуле (11):
t0 = Lr2mTjF,
где L - длина колонки, см, г — радиус колонки, см, и F — скорость потока, см3/с. Общая пористость ?7 для полностью пористых носителей (независимо от метода заполнения) равна 0,84 ± 5%. Для химически связанных фаз, а также для ионообменников ?7 всегда меньше. В предельном случае ег равна 0,42 (например, для непроницаемых стеклянных шариков). В системах с обращенной фазой с хорошим приближением Вт можно принять равной 0,75.
в) Диаметр частиц насадки, приведенный поставщиком, не обязательно совпадает с «эффективным гидродинамическим диаметром» частиц, который влияет на разделительную способность и проницаемость колонки. Как показано в разд. II. Е, гидродинамический диаметр частиц можно определить по проницаемости разделительной колонки или по перепаду давления, необходимому для создания определенного потока через разделительную колонку. Преобразуя уравнение (29), согласно данным работы [25], получаем
